前言

考马斯亮蓝灵敏度太低？操作中使用的甲醇有毒性？今天我们分享一个秘籍，让考马斯亮蓝染色更安全、更灵敏！

正文

考马斯亮蓝G250，即二甲花青亮蓝，英文全称Coomassie Brilliant blue G-250。每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，带负电，可以通过静电相互作用结合到蛋白质的碱性氨基酸上（精氨酸、赖氨酸、组氨酸）。考马斯亮蓝染色是一种经典的蛋白染色方法，常用于凝胶中蛋白条带的显示。考马斯亮蓝染色相对其他方法操作便利，步骤简单，且与质谱兼容性很好。但在灵敏度方面，通常认为银染法更灵敏，可达0.1ng，而考马斯亮蓝法通常认为只能染出最低50-100ng的蛋白条带。

（上：考马斯亮蓝G250；下：考马斯亮蓝染色结果图片）

本篇给大家推荐一种改进的胶体考马斯亮蓝染色方法。研究人员改进了配制方法，不仅替换掉了有毒的甲醇，还使得染料分子呈胶体颗粒状，大大提升了染色的速度和灵敏度。这种新型的方法，将考马斯亮蓝的染色灵敏度提升几十倍，最低可达1ng左右的蛋白条带。

胶体考马斯亮蓝G250染液配制方法

该配方需要以下几种试剂：硫酸铝，无水乙醇，考马斯亮蓝G250，85%的磷酸，去离子水。以配制500mL染液为例，方法如下：

1. 用375mL去离子水充分溶解25g硫酸铝。

2.加入无水乙醇48mL，充分混匀。

3.称取考马斯亮蓝G250染料0.1g，充分混匀。

4.加入85%的磷酸11.75mL，充分混匀。

5.加入去离子水，定容至500mL。

6.将配制好的染液装于棕色瓶中，室温暗处保存，用前摇匀。

脱色液比较简单，以500mL为例，配制方法是：将48mL无水乙醇加入375mL水中溶解，再加入85%的磷酸11.75mL，混匀，最后加水定容至500mL。

SDS-PAGE中蛋白条带的染色和脱色

考染过程中需要注意一些细节，会获得更好的蛋白条带。使用该染色的染色和脱色步骤如下：

1.SDS-PAGE跑胶完成后，戴干净一次性手套将胶块取出，去除浓缩胶部分。将胶块放置在干净的器皿中，加入蒸馏水清洗胶块3次，将胶块中的SDS洗掉，否则会妨碍染色过程。

2. 取出保存的染液，摇匀后，加到放置胶块的器皿中，需淹没胶块，盖上盖子后放到摇床上孵育。

3.通常染色2小时内可使80%的蛋白条带出现，推荐染色过夜，使染色更完全。

4.如果染色条带显示不佳，可倒掉染液，重新换一遍新的染液继续孵育，至染色效果理想。

以下是脱色过程：

5.染色完成后，倒掉染液，先用水洗去残留的染液。该方法通常染色背景较浅，此时应该已经可以看到很多明显的条带。

6.如需进一步脱色，加入脱色液，摇床上孵育至条带更明显。如一遍脱色不够，可按需更换脱色液继续脱色。

注意事项

1. 操作胶或染色过程中，需保持器皿和手套的干净，以免污染影响染色或影响后续质谱检测需求；染液也不建议重复使用，以免影响染色和造成交叉污染。

2. 由于此方法染色背景相对较浅，可以不用脱色液，用蒸馏水来脱色通常也可以达到不错的效果。

3.染色和脱色完成后，及时拍照/扫描保存胶图，做好标记和记录。

4.关于胶的保存，如需短期保存胶块，可用3%的乙酸浸没胶块，存在4度冰箱；如需质谱鉴定蛋白条带，则需切取目的条带，放在干净的EP管中，把残余液体吸去，保存在冰箱，等待送样即可。

5.往期文章《蛋白互作组学系列丨（三）IP-MS方案设计》（点击查看）提到的在IP-MS项目送样前要用WB和SDS-PAGE染色来评估IP特异性和IP后的蛋白量，其中的SDS-PAGE染色可以参考该方法来操作。

参考文献

1. Dyballa N., Metzger S. (2009). Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. JoVE. 30. http://www.jove.com/details.php?id=1431,

doi: 10.3791/1431

2. Kang, D., Gho, S.G., Suh, M. & Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002)