期刊名称：Life Sci Alliance              

发表时间：2021年10月

影响因子：4.4

期刊分区：JCR Q1区/生物学2区

作者单位：台州大学附属医院                    

定量方法：LFQ                               

样本类型：血清

01 前言

今天和大家分享一篇2021年10月发表在Life Sci Alliance（IF=4.4）杂志上，标题为“Serum proteomics reveals disorder of lipoprotein metabolism in sepsis”的文章。这篇文章的实验设计较为简单，主要通过蛋白质组学检测，结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）以及相关验证，确定关键蛋白。有快速发文需求的小伙伴们可以借鉴这篇文章的检测和分析思路哦！ 

02 研究背景

脓毒症是严重感染、创伤、外科手术以后，伤口被细菌等病原微生物侵入，引起的全身性炎症反应综合征。临床上常见的就是败血症和脓毒血症，根据年龄和疾病严重程度不同，其死亡率高达30%～70%。感染发作时，最先受到影响的就是血液，它的造血功能、传输能力都被破坏，造成血液中白细胞和不成熟细胞数量增多，表现为浑身酸痛。目前对这种综合征的有效治疗方法很少，因此本研究旨在分析脓毒症患者血清的蛋白质组学，以表征脓毒症的病理机制和途径，以期找到诊断标志物并进行后续的药物开发。

03 研究样本

共收集176例血清样本，脓毒症患者和NC（Normal Control）对照组的年龄和性别无差异，临床特征相对保持一致。

04  实验设计

图1 实验路线

该研究共纳入176例血清样本，其中脓毒症114例和NC对照组62例，然后随机分为推导队列和验证队列。利用推导队列90例样本（脓毒症59例，NC对照组31例）进行LFQ定量蛋白质组学检测，通过差异分析统计显著差异蛋白数目和WGCNA分析确定高共表达蛋白质模块，筛选出枢纽蛋白；再利用验证队列86例样本（脓毒症55例，NC对照组31例），通过ELISA进一步验证相关的枢纽蛋白。

05 实验结果

（1）脓毒症患者血清的蛋白质组学分析

通过LFQ蛋白质组学分析，总共鉴定到879个蛋白，选择396个缺失值不超过40%的蛋白进行后续分析。基于396个蛋白的主成分分析图显示脓毒症患者和NC组之间存在明显的分离；进一步通过P< 0.05且 | log2FC | >1.5的标准，筛选出62个差异蛋白，其中49个表达上调，13个表达下调。通过GO注释和富集分析表明，这些差异蛋白主要富集于急性期反应、细胞外基质组织、内皮细胞凋亡过程、细胞黏附分子结合、抗氧化活性和受体结合等过程。

图2 蛋白质组学分析

（2）构建脓毒症蛋白质共表达网络

基于从蛋白质表达矩阵中提取的成对蛋白质表达相关性，利用WGCNA构建蛋白质共表达网络，确定了18个高共表达蛋白质模块，每个模块由5-89个不等的蛋白质组成，图中以不同的颜色表示。采用两种方法检验各模块与疾病状态的相关性：首先构建各模块与脓毒症相关性的条形图，模块显著性越大，表明模块与疾病状态的关联越大，结果显示MEturquoise模块的显著性在各模块中最高；随后计算各模块与疾病表型之间的相关性，结果显示MEturquoise模块与脓毒症表型高度相关，相关系数为0.93。基于这两个结果，MEturquoise模块被认为是与脓毒症最相关的模块。

图3 蛋白质共表达网络的构建和分析

随后为进一步阐明脓毒症的发病机制，对MEturquoise模块的特征蛋白质进行功能富集分析。共识别出202个GO条目，并进一步归为32个组，这些特征蛋白质主要富集在血浆脂蛋白颗粒重塑、脂质转运调节、胆固醇生物合成过程、急性炎症反应、伤口愈合调节、细胞解毒和凋亡信号通路调节等过程。基于以上结果，调节血浆脂蛋白颗粒水平和脂质代谢过程可能是脓毒症病理生理的核心。

图4 MEturquoise模块中显著富集的通路网络

（3）脓毒症患者器官功能紊乱促使蛋白质网络模块改变

为了探讨脓毒症相关性脑病(SAE)患者的网络变化特征，作者计算了模块成员与不同脑病表型之间的相关性。结果显示MEyellow模块与SAE患者高度相关，并且该模块的特征蛋白值在SAE组、非SAE组和NC组间有显著差异 (p < 0.05)。对该模块蛋白进行功能富集分析，结果显示主要富集于补体激活、免疫反应和细胞黏附相关的生物学过程。

图5 脓毒症相关性脑病(SAE)患者蛋白质网络模块的变化

类似的相关性分析显示，MEred模块与脓毒症相关性急性肾损伤(AKI)高度相关，其模块特征蛋白值在不同AKI表型间存在显著差异。功能富集分析显示，脂蛋白代谢过程、甘油三酯稳态、内肽酶活性负调控等过程均富集于MEred模块。

 图6 脓毒症相关性急性肾损伤(AKI)患者蛋白质网络模块的变化

（4）脓毒症相关蛋白质的鉴定和验证

脓毒症最相关MEturquoise模块中共有81个蛋白质成员，通过散点图显示该模块蛋白质成员与脓毒症状态的显著相关性(cor= 0.79，p = 9.9 × 10−86)；为了进一步研究MEturquoise模块的关键调控蛋白，作者构建了加权子网络，最终确定12个枢纽蛋白，且这些蛋白质在脓毒症患者中特异性表达。然后随机选择4种蛋白质（CRP、LBP、A2GL和SAA1）进行ELISA验证，结果表明4种蛋白质的表达模式与初筛分析结果一致。这些结果表明枢纽蛋白的表达水平具有高度特异性，可以作为诊断脓毒症患者的生物标志物。

 图7 脓毒症高度相关蛋白质分析和关键蛋白验证

06 结论

本研究通过LFQ定量蛋白质组学，分析了脓毒症患者的血清蛋白质组学特征。通过WGCNA分析，筛选鉴定出分别与脓毒症、脓毒症相关脑病或脓毒症相关急性肾损伤相关的蛋白质模块，揭示了脓毒症生物过程高度相关的枢纽蛋白，为诊断脓毒症提供了有用的工具，并为理解脓毒症的病理生理学提供了新的见解。

07 总结

本文进行了大量样本的LFQ蛋白质组学检测，在常规差异表达分析之外，通过WGCNA分析来进一步筛选疾病和疾病亚型相关的枢纽蛋白，并通过验证队列的ELISA检测进行了验证。研究思路较为简单，实验难度也较低。但本文对蛋白质组学数据的使用并不充分，虽然引入了WGCNA分析方法，但并未针对疾病的诊断进行临床建模，对于疾病相关的生物过程也未进行深入探讨和验证。若结合临床信息，使用机器学习的方法建立临床诊断或鉴别诊断模型，或在细胞或动物模型中对相关生物学过程涉及的枢纽蛋白和信号通路进行进一步功能验证，文章的结果和结论将具有更重要的研究意义。

08  参考文献

Liang X, Wu T, Chen Q, Jiang J, Jiang Y, Ruan Y, Zhang H, Zhang S, Zhang C, Chen P, Lv Y, Xin J, Shi D, Chen X, Li J, Xu Y. Serum proteomics reveals disorder of lipoprotein metabolism in sepsis. Life Sci Alliance. 2021 Aug 24;4(10):e202101091. doi: 10.26508/lsa.202101091, PMCID: PMC8385306.