期刊名称：Arthritis & Rheumatology

发表时间：2023年3月

影响因子：13.3

期刊分区：JCR 1区/医学1区

作者单位：北京协和医学院、国家蛋白质科学中心

定量方法：DIA

样本类型：血浆

其他信息：白塞病，生物标志物，分子分型，129例

 

前言

 

大家好，在上期《破译疾病密码|深度解析血液蛋白质组的无限可能性》中，我们向大家介绍了血液作为检测样本的优势以及在蛋白质组学中的研究现状和应用场景。

通过本期文章，小谱将为大家详细介绍一篇文献案例，带大家进一步了解血液样本的蛋白质组学研究是如何开展的。这篇文章于2023年3月发表在双一区杂志Arthritis & Rheumatology（IF=13.3）上，标题为“Proteomics Landscape Mapping of Organ-Resolved Behçet's Disease Using In-Depth Plasma Proteomics for Identifying Hyaluronic Binding Protein 2 Expression Associated With Vascular Involvement”。

研究背景

 

白塞病（BD）是一种以血管炎症为病理基础的慢性进行性疾病，但目前我们并不清楚导致这种疾病的具体原因。该病会导致人体内的多个系统发生反复损害，而不同器官系统受损的BD患者之间有很大的异质性，它们的分子特征尚不清楚。

为了更好地理解白塞病，本研究通过蛋白质组学分析对BD患者进行了分子亚型细分，并发现了可指示疾病严重程度的潜在生物标志物。 

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研究样本

 

发现队列：98名BD患者和31名健康对照（HC）的血浆样本。

ELISA验证队列：108名BD患者和29名HC的血浆样本。

 

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实验设计

 

本研究采用横断面研究设计，研究对象均来自北京协和医院。BD患者的确诊依据为1990年国际研究组标准或白塞病国际标准，并根据Krause评分将其分为轻度组、中度组和重度组，可反映BD患者的器官病变程度和疾病进展。HC则从同期体检中心招募，排除了自身免疫性疾病、糖尿病及心血管疾病病史。

 

研究团队收集了研究对象的血浆样本，并运用DIA和抗体芯片技术进行检测，用于比较BD患者和HC的血浆蛋白质组学差异。

 

 

研究结果

 

（1）差异蛋白分析

 

该研究共鉴定到759个蛋白质，其中410个为HDPP数据库（Human Disease Plasma Protein Biomarker Database）中收录的人类疾病血浆蛋白生物标志物，388个为TTD数据库（Therapeutic Target Database）中收录的已获批或正在进行临床试验研究的治疗靶点。在鉴定到的759个蛋白中，有220个在BD患者和HC中显著差异表达（P <0.05）。

 

利用DisGeNET数据库进行疾病富集分析，结果显示：这些差异表达的蛋白质与炎症、自身免疫和血管疾病高度相关。生物过程富集分析显示，BD主要富集的生物过程包括：1）补体激活；2）血浆脂蛋白水平的调节；3）伤口愈合；4）血管生成；5）白细胞介导的免疫；6）肽酶活性；7）细胞活化的正调节；8）白细胞迁移。这些生物过程与BD发展过程中的炎症和凝血的病理机制相符合。

 

图2  差异表达蛋白相关结果

 

（2）BD患者分子分型

 

为了揭示BD患者之间的异质性，研究者对220个差异表达蛋白进行了无监督共识聚类分析，将BD患者分成了三个蛋白质组亚型。主成分分析显示亚型I、II与亚型III有明显的分离。对各亚型的特异性蛋白进行生物过程富集分析，结果显示亚型I的特异性蛋白主要参与凝血和补体激活过程，亚型II的特异性蛋白主要参与葡萄糖和蛋白质脂代谢过程，亚型III的特异性蛋白参与炎症反应过程。亚型I和亚型II相似，患者的疾病严重程度较高，涉及神经系统和血管；而亚型III的患者症状相对较轻，但皮肤损伤的患者比例更高。

 

根据临床数据（包括性别、年龄、严重程度评分和临床表现），研究者采用两步聚类分析法将BD患者划分为不同的临床亚组。第一步，通过对数似然法确定了聚类之间的相似性；第二步，根据贝叶斯信息准则决定了聚类的数量。最终，作者将BD患者分为了两个临床亚组，分别为临床组1和临床组2。

 

蛋白质组亚型I、II和临床组1的患者具有相似的临床特征，表现为多器官受损和更高的疾病严重程度。蛋白质组亚型III和临床组2中的患者表现出相似的临床特征。作者通过无偏见的分层聚类分析进一步验证发现，最终蛋白质组亚型III的患者被归入临床组2，蛋白质组亚型I和II的患者被归入临床组1。这些结果表明，基于蛋白质组学将BD患者进行分类对于指示BD的异质性和严重程度有潜在的实用价值。

 

 （3）筛选并验证指示BD严重程度的生物标志物

 

研究者通过关联分析和趋势分析筛选与BD严重程度相关的蛋白标志物。如果差异蛋白符合以下任一标准，就可以认为它们与BD严重程度有关：（1）通过Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较事后检验，或一元方差分析和Tukey多重比较检验，在HC和轻度、中度、重度BD组中显示蛋白表达量上升或下降的趋势，且P <0.05；（2）通过Spearman或Pearson相关性分析，发现蛋白质表达量与疾病严重程度评分呈显著相关，P <0.05。

 

基于上述标准，研究者最终筛选得到7个蛋白作为候选蛋白（TNC，HABP2，SERPINA3，ATRN，C4BPA，GPLD1和C5），并在一个由108名BD患者和29名HC组成的独立队列中进行验证。其中HABP2、TNC和SERPINA3在BD患者中的表达水平升高，它们的含量与疾病严重程度呈正相关。这提示HABP2、TNC和SERPINA3可作为潜在BD生物标志物，用于指示疾病严重程度。

 

图3  分子分型结果

 

（3）筛选并验证指示BD严重程度的生物标志物

 

研究者通过关联分析和趋势分析筛选与BD严重程度相关的蛋白标志物。如果差异蛋白符合以下任一标准，就可以认为它们与BD严重程度有关：（1）通过Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较事后检验，或一元方差分析和Tukey多重比较检验，在HC和轻度、中度、重度BD组中显示蛋白表达量上升或下降的趋势，且P <0.05；（2）通过Spearman或Pearson相关性分析，发现蛋白质表达量与疾病严重程度评分呈显著相关，P <0.05。

 

基于上述标准，研究者最终筛选得到7个蛋白作为候选蛋白（TNC，HABP2，SERPINA3，ATRN，C4BPA，GPLD1和C5），并在一个由108名BD患者和29名HC组成的独立队列中进行验证。其中HABP2、TNC和SERPINA3在BD患者中的表达水平升高，它们的含量与疾病严重程度呈正相关。这提示HABP2、TNC和SERPINA3可作为潜在BD生物标志物，用于指示疾病严重程度。

 

图4  独立队列ELISA验证目标蛋白

 

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结论

 

本研究利用高通量蛋白质组学技术，对BD患者的血浆蛋白质组学特征进行了全面分析，揭示了不同蛋白质组学亚型BD患者的特征蛋白以及这些蛋白参与的生物学通路，为解释BD的异质性和发病机制提供了参考。研究筛选并成功验证了血浆蛋白HABP2、TNC和SERPINA3的临床价值，它们被确定为指示BD患者疾病严重程度的潜在生物标志物，为未来的临床实践提供了有力的支持。

 

07 总结

 

对于那些患者之间异质性较大、难以确定疾病发生时间无法前瞻性收集样本的疾病研究，这篇文章的思路非常值得借鉴。

本研究的亮点在于：

（1）这是第一个全面分析不同器官受累BD的蛋白质组学特征的研究，纳入了迄今为止最大规模的BD队列，其结果为解释BD的异质性和发病机制提供了参考；

（2）对于筛选到的差异蛋白，作者通过挖掘各种数据库（TTD、HDPP、DisGeNET）和一系列生信分析丰富了差异蛋白的生物学特征。
本研究也存在一些局限性，

例如：

（1）研究中确定的生物标志物可以在更大的多中心队列中进行验证；

（2）文中对照组选择的是健康人群，但在临床研究中需要考虑实际应用的可行性，使用更为合理的对照，例如本文可以用不同的自体炎症和自身免疫病患者样本为对照；

（3）研究的BD患者中既有经过治疗的也有未经治疗的，治疗在这项研究中是一个混杂因素，有可能会影响数据分析的结果，最好对其进行控制或排除。

 

阅读这篇文章后，您可能会思考：“我是不是也能够获取血液样本进行生物标志物和分子分型研究？能不能也充分利用多个数据库来丰富研究结果？”

 

别担心，谱度众合提供深度血液蛋白质组学解决方案，无论是分子分型，还是生物标志物筛选都不在话下！我们充分考虑客户需求，报告中自带数据库挖掘，HDPP、TTD和DisGeNET多种数据库一网打尽，不仅分析检测数据，还进一步深挖疾病标志物、药物靶标、疾病关联性的拓展信息，为客户提供更为丰富的参考结果，一站式满足您的多元化需求！欢迎随时联系我们！

 

知识小卡片

HDPP数据库（Human Disease Plasma Protein Biomarker Database）系统收录PubMed文献中发表的疾病相关的血浆中的蛋白质，包含 1,173 种人类疾病的 3,490 种血浆蛋白和生物标志物，是进行血浆标志物研究的重要参考数据库。

 

TTD数据库（Therapeutic Target Database）中收录了已获批或正在进行临床试验研究的蛋白或核酸靶点的相关信息，且全部数据均有参考文献来源，是药物靶标发现和新药开发领域具有国际影响力的数据平台。

 

DisGeNET数据库收集和整合了来自多个数据源的疾病与基因之间的关联信息，支持研究者们在疾病研究、药物开发和个性化治疗方面进行深入的分析和研究。