胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤，属于WHO 4级分型恶性肿瘤。尽管胶质母细胞瘤治疗方式包括手术切除、放射疗法和化学疗法（替莫唑胺联合放化疗），但其复发率仍接近100%。目前针对初始诊断和复发胶质母细胞瘤在蛋白质组水平上的理解仍然非常有限。

这项研究使用PCT-SWATH技术，得到两组患者队列中原发性和复发性胶质母细胞瘤的定量蛋白质组数据，而后进行分析，并通过实验手段和外部数据进行验证，揭示了FBXO2可能具有微环境依赖性的促肿瘤作用可被列为潜在药物靶点，为胶质母细胞瘤蛋白质组学研究提供了宝贵资源。

本研究使用两个独立患者队列的组织样本：队列1包含26名患者的不同肿瘤区域的4~5个组织穿孔样本（1×2 mm）；队列2包含16名患者肿瘤含量超过75%的完整组织切片。且每位患者都收集初诊和复发时的胶质母细胞瘤样本，所有肿瘤样本均为IDH野生型，且患者都已接受替莫唑胺放化疗治疗。

细胞系/动物模型：人胶质瘤细胞系LN-229和胶质瘤起始细胞系ZH-161及裸鼠原位异种移植模型。

图1 研究流程

本研究对FFPE样本进行了定量蛋白质组学检测，通过差异比较分析和免疫组织化学染色，筛选并验证了与肿瘤复发相关的关键蛋白，随后构建人类胶质瘤敲除细胞系对蛋白的功能进行验证。研究中既包含了体外实验，如生长和细胞克隆实验以及球体侵入实验；也包含了体内实验，如构建原位异种移植小鼠模型和器官型脑组织切片培养实验；此外整合大量外部的组学数据进行同步分析，揭示了依赖FBXO2的胶质瘤与微环境相互作用可以促进肿瘤生长的，为改善GBM的治疗效果提供潜在的药物靶点。

蛋白质组定量数据显示，在两个队列中共检测到8607种共有protein groups（PG），其中至少40%的样本中能够定量到3001种共有PG。对全局蛋白进行主成分分析时，两组队列中原发性和复发性样本并没有明显区分（图2A），且两者蛋白平均表达丰度高度相关（图2B）。对前500个可变蛋白进行聚类分析，没有发现其他临床亚组中（如MGMT启动子甲基化状态、无进展生存期或总生存期）的明显聚类（图2C）。以上结果表明原发性和复发性胶质母细胞瘤在蛋白质组整体层面高度相似。

然而与新发肿瘤相比，复发患者中样本之间的蛋白相关性显著降低，意味着复发时胶质母细胞瘤的总体异质性较高（图2D）；在进行基因集富集分析Reactome通路时，研究者发现部分显著富集通路与翻译延伸的修饰相关（图2E），这些通路通常与肿瘤复发相关。

图2 初诊和复发的胶质母细胞瘤的蛋白质组学景观总体相似

图3 BCAS1、FBXO2和INF2在复发时丰度更高

为了验证BCAS1、FBXO2和INF2在胶质母细胞瘤中的功能，作者通过CRISPR/Cas9-RNP技术，针对人胶质瘤细胞系LN-229和胶质瘤起始细胞系ZH-161，构建了三个关键蛋白的敲除细胞系。使用PCR、Sanger测序和免疫印迹技术验证了敲除的成功。

尽管BCAS1、FBXO2和INF2的敲除细胞系在体外实验中的生长情况和细胞克隆形成方面表现出不一致的表型，但在体内实验中，FBXO2敲除提高了小鼠的存活率和长期存活小鼠的比例，同时减少了肿瘤生长，在人脑片培养中也表现出更少的侵袭性生长（图4A、B）。

与此同时，通过分析TCGA（癌症基因组图谱）中MRI和转录组学数据，发现FBXO2高表达的肿瘤球形度降低，这表明肿瘤浸润区域更为分散（图4C）。

图4 BCAS1、FBXO2和INF2敲除功能验证体内实验

单细胞RNA测序数据显示，表达FBXO2的胶质瘤细胞与具有反应性免疫特征和神经发育转录程序的肿瘤区域相关。此外FBXO2富集的肿瘤区域与神经发育、NPC/OPC样和前膜基因特征之间存在很强的空间相关性（图5A、B）。

作者通过外部空间转录组学数据分析了FBXO2的表达情况。在健康大脑皮层中，FBXO2的表达仅限于新皮层的L1层（神经祖细胞的生态位）；而在胶质母细胞瘤组织中，FBXO2的表达在肿瘤浸润区显著富集，并且与初始诊断样本相比，复发组织样本中FBXO2的表达显著上调（图5C-E）。

此外基于外部bulk RNA测序和单细胞RNA测序数据，FBXO2表达富集的信号通路与调节突触活性相关（图5F）；与此同时，人脑切片培养中胶质瘤细胞附近PSD-95阳性突触点减少（图5G）。以上结果表明在胶质瘤细胞中，FBXO2可能介导了与周围中枢神经系统组织的相互作用。

图5 FBXO2表达的空间分布特征

本研究通过蛋白质组学技术对原发性和复发性胶质母细胞瘤患者进行蛋白定量分析，发现BCAS1、INF2和FBXO2在复发性胶质母细胞瘤中一致上调，并使用免疫组织化学验证了这一趋势。FBXO2敲除的人胶质瘤细胞在原位异种移植小鼠模型中显示出生存优势，并减少了器官型脑切片培养中的侵袭性生长。在胶质母细胞瘤患者样本中，FBXO2在肿瘤浸润区富集表达，并且FBXO2阳性的癌细胞与突触信号传导过程相关。这些发现证明了依赖FBXO2的胶质瘤-微环境相互作用在促进肿瘤生长中的潜在效果。

本文是对疾病分子机制的研究，脉络清晰，框架完整（从发现队列—定量蛋白质组学—关键蛋白筛选—下游蛋白功能验证）。研究思路和文章框架值得参考借鉴。

本文的独特之处在于收集了同一患者在初诊和复发时的样本并进行比较研究。此外结果分析采取了蛋白质组学+转录组学结合的方式，，并使用了大量外部数据，与实验得到的直接结果相互佐证，增加了实验结果的可信度和说服力。

本研究通过对胶质母细胞瘤在蛋白组学层面的研究，揭示了FBXO2可能具有微环境依赖性的促肿瘤作用。但本文也存在一些局限性，例如本研究中样本量较小，在胶质瘤细胞模型中，FBXO2敲除并未在体外显示出一致的表型，仍需要更多研究数据来探索潜在的分子机制。

文献原文：

Buehler M, Yi X, Ge W, et al. Quantitative proteomic landscapes of primary and recurrent glioblastoma reveal a protumorigeneic role for FBXO2-dependent glioma-microenvironment interactions. Neuro Oncol. 2023;25(2):290-302. doi:10.1093/neuonc/noac169