Figure 1 新药物研发流程

药物靶点相关研究围绕着疾病-靶点-药物三者开展，针对不同的研究背景有着多种具体的研究思路。

首先最直接的是寻找新的疾病靶点。这也是经典的生物标志物研究思路，比较疾病人群与对照人群的差异，寻找疾病过程中发生改变的重要生物功能分子。这些生物分子可以作为后续药物研究的潜在疾病靶点，也可以作为疾病诊断、预后、分型等研究的生物标志物。

第二个研究思路是针对已知有效药物但不明确药物靶点（药物作用机制）的场景。在这个思路下，有三种常见的研究类型。第一种是直接的寻找药物发挥作用的治疗靶点；第二种是针对药物不良反应的研究，分析药物的脱靶靶点；第三种是针对一些已知药物新用途的研究，通常是筛选FDA批准的药物库，发现与药物原本治疗效应不同的新用途。这个思路对应于新药研发中的基于表型的药物研发（Phenotypic Drug Discovery,PDD），即明确药物的药效（表型）之后筛选药物作用靶点。

第三个思路是针对特定靶点开发药物的研究场景。除了使用药物（化合物）库和计算方法（虚拟筛选）进行大规模反向筛选之外，基于蛋白质组学的筛选新技术也正发挥着越来越关键的作用。基于活性的蛋白质组学分析（ABPP）可以根据靶点的活性位点设计一系列活性探针（候选分子），再通过蛋白质组学检测，分析探针的灵敏度与特异性，最终得到针对特定靶点的合适活性药物。此外，药物研发领域常见一类不可成药的靶点，不可成药是指这一类靶点以现有的方法难以找到与之有效结合的药物。针对这一类靶点，PROTAC和分子胶技术应运而生，它们利用生物体天然存在的蛋白清理系统（泛素-蛋白酶体降解系统等）将靶蛋白导向降解，进而产生类似抑制剂的药物活性。这个思路对应于新药研发中的基于靶点的药物研发（Target-based Drug Discovery, TDD），即针对特定靶点开发或者筛选有效药物。

Figure 2 药物靶点研究场景与思路

用于筛选药物治疗靶点的方法有很多，包括遗传技术（突变、基因敲除等）、计算技术（虚拟筛选、分子对接等）、分子技术（CETSA、MST、SPR等）以及基于质谱的蛋白质组学技术（LiP-MS、TPP、ABPP等）。其中最好的方法是蛋白质组学的相关技术，原因有以下几点：

在这种背景下，研究中常使用蛋白质组学技术作为药物靶点筛选的主要技术，其他的技术则作为辅助的验证手段。

​

基于蛋白质组学的药物靶点筛选方法，其本质是发现药物与靶蛋白的相互作用。因为药物发挥作用的基础是与靶蛋白相互作用，进而通过影响靶蛋白活性对机体的生理病理过程产生影响。目前基于药物-靶蛋白相互作用这一原理，衍生出了多种蛋白质组学药物靶点筛选方法。其中最容易理解的是基于亲和性的蛋白质组学方法，利用药靶互作通过AP-MS的原理来捕获鉴定靶蛋白。另一类方法是基于药物-蛋白相互作用能影响靶蛋白的生化性质的原理，包括但不限于影响蛋白的热稳定性、酶切抗性、对氧化剂、有机溶剂等胁迫条件的抗性等等。

接下来将为大家详细介绍两种最常见的基于蛋白质组学的药物靶点筛选方法：LiP-MS技术和TPP技术。

Figure 3 蛋白质组学药物靶点筛选方法分类及发展历史

有限蛋白水解质谱技术（Limited Proteolysis Mass Spectrometry，LiP-MS）是一种应用非常广泛的一种蛋白质组学药物靶点筛选方法，其原理是药靶结合能提高靶蛋白酶切的稳定性。“LiP-MS”中的“LiP”是“有限水解”的缩写，它是指在生理状态下蛋白酶对蛋白的不完全酶切。研究表明，生理状态下折叠的蛋白具有较强的抗酶切能力，所以实验中想要实现对蛋白的完全酶切需要先对蛋白进行变性处理（去折叠）。

而在生理状态下，折叠蛋白的不完全酶切也需要蛋白酶识别位点的暴露，通常涉及到多达12以上氨基酸残基肽段的构象变化(局部展开)，这依赖于蛋白的动态变化——蛋白表面肽段的柔性变化可能会形成这种能被蛋白酶识别切割的位点。

Figure 4 有限水解概念图

Figure 5 药物作用提高蛋白稳定性

Figure 6 LiP-MS实验流程图

热蛋白质组分析（Thermal Proteome Profiling，TPP）的原理是药物与靶蛋白结合后会引起蛋白的热稳定性变化。实验时在梯度温度处理下蛋白会发生不同程度的变性，进而呈现特定的热变性曲线，而在药物处理下靶蛋白的热变性曲线会发生偏移（更稳定或者更敏感）。通过蛋白质组学检测蛋白的热稳定性变化，其中发生显著变化的即为药物的潜在作用靶点。 

相比于LiP-MS技术，TPP需要设置多个温度处理组（8-10个温度点），并使用TMT标记试剂，因此在人力物力上的消耗成本更高。为了弥补这一弊端，很多研究基于同样的原理开发了一些TPP衍生方法，例如单温度点的ITSA技术与多温度点混样的PISA技术，将TPP技术推向了高通量的药物筛选应用层面。

Figure 7 TPP实验流程图

Figure 8 各种类型TPP实验技术

蛋白质组学技术可以帮助我们从庞大的蛋白质组中筛选出药物的潜在作用靶点，这些潜在靶点通常还需要进行验证。因为药物分子除了作用在治疗靶点上，还能作用在一些可能引起药物不良反应的其他蛋白靶标上。这就需要我们根据研究的疾病主题进一步筛选了。

完整的研究通常需要验证治疗靶点的真实性，相关的验证手段可以分为三个层面。首先是药物-靶点互作验证，常用的有WB水平的实验技术——DARTS与CETSA；分子层面的技术——SPR与MST；还有计算层面的技术分子对接与分子动力学模拟等。进一步地，还可以对药靶互作的功能进行验证，对于酶类靶点，可以检测药物对其活性的影响；或通过基因敲除、过表达等遗传学实验来验证靶点依赖性的药效。最后，可以深入研究药物作用的分子机制，探究药物靶点的上下游生物学通路过程，明确药物/疾病表型的底层分子机制。

Figure 9 药物靶点的验证

本文介绍了新药研发流程中有关实验室阶段的药物靶点筛选研究过程。围绕疾病-药物-靶点三个主题，讨论了在不同的研究场景中可以采取的不同研究设计。

基于质谱的蛋白质组学药物靶点筛选方法具有独特的优势，可以很好地应用于根据药物筛选靶点这一最常见的研究场景。这里提供一个完整的药物靶点研究设计总结：首先通过蛋白质组学技术筛选出潜在药物靶点，而后结合疾病药物和蛋白功能等相关信息和研究者的经验，从中挑选可能的药物靶点进行验证，最后从药物-靶蛋白互作、药物靶点功能分析、药物作用机制研究等角度深入验证和分析药物靶点与疾病的相互关系和分子机制。