DARTS技术由Lomenick团队于2009年在《美国国家科学院院刊》（PNAS）首次报道。其理论基础源于对生物大分子相互作用的深入观察：当DNA与转录因子结合，或蛋白质与天然配体（如糖类、核酸）相互作用时，其结构稳定性显著增强，表现为对核酸酶或蛋白酶的水解抗性大幅提高。基于这一现象，研究者提出了一个创新性假说：小分子药物与靶蛋白结合后，可能会增强靶蛋白对蛋白酶解的耐受性。

为验证这一假设，研究团队在重组蛋白体系中进行了系统实验。他们以经典的药靶对FKBP12及其抑制剂雷帕霉素/FK506作为模型，发现经药物处理的FKBP12对枯草杆菌蛋白酶的敏感性显著降低（EC50下降约5倍），而无关药物则无此效应。进一步在结合力较弱的E4-mTOR系统中重复实验，仍观察到显著的水解保护现象，从而初步证实了该方法的普适性。

Figure 1 DARTS技术原理示意图A、DARTS技术概念图B、重组人FKBP12蛋白与指定的药物共同孵育后，经枯草蛋白酶消化的原理验证C、mTOR激酶抑制剂E4的DARTS实验

在复杂生物体系验证中，研究采用了靶向EF-1α的天然产物didemnin B处理Jurkat细胞。通过SDS-PAGE分析，药物处理组在50 kDa区域出现了明显的保护条带，质谱鉴定确认为EF-1α蛋白。进一步的免疫印迹实验表明，EF-1α的酶解保护效应呈现药物浓度依赖性，为DARTS技术的可行性提供了直接证据。

Figure 2 全细胞裂解液DARTS实验A、完整的Jurkat细胞用DB（1 g/ml）处理，并对裂解液进行嗜热菌蛋白酶消化和考马斯亮蓝染色B、通过质谱分析揭示保护条带中的EF-1蛋白C、通过免疫印迹检测DARTS

基于这些基础研究，研究团队通过多组药靶对验证了该技术的通用性，并成功实现了对药物白藜芦醇分子靶标的筛选。DARTS技术因其操作简便、无需化学修饰等优势，迅速成为药物靶点筛选的重要工具，至今仍被广泛应用于靶标发现研究。

以哺乳动物细胞为典型样本，推荐使用非变性裂解缓冲液（如TNC缓冲液：50 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，10 mM CaCl2，pH 8.0）。蛋白酶的选择需根据靶蛋白特性进行优化，常用的酶包括枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶及链霉蛋白酶（后者应用最广泛）。

⭐蛋白提取：用预冷的PBS清洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（500 μL/10cm培养皿）。通过超声破碎（10 s脉冲×3次，功率30%）或冻融循环（液氮/37℃交替3次）完成裂解。

⭐药物处理：4℃下12,000 ×g离心15分钟，取上清进行蛋白定量（BCA法）。调整蛋白浓度至4-6 μg/μL后分组处理：实验组加入药物（推荐终浓度为10×IC50，最高不超过200 μM），对照组加入等体积溶剂，室温孵育1小时或4℃孵育过夜。

⭐酶解反应：将链霉蛋白酶梯度稀释（按照蛋白酶与样本中蛋白量的比例：0、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000）。每组样本分装后加入对应浓度的酶液，每份样本均保留一半作为非酶解对照组。室温反应30分钟，通过95℃加热5分钟终止反应（可加入Loading Buffer）。

⭐靶标鉴定：通过SDS-PAGE（考马斯亮蓝/银染）进行初筛，差异条带经胶内酶解后进行质谱分析。定量验证建议采用Western blot，以内参蛋白（如β-actin）作为对照。

尽管如此，随着蛋白质组学技术的不断进步，基于质谱的LiP-MS（Limited Proteolysis-MS）及TPP（Thermal Proteome Profiling）等新兴方法逐渐成为主流。然而，DARTS技术在靶标验证环节仍具有独特价值，可与这些新兴技术形成互补。

DARTS（药物亲和响应靶标稳定性）与LiP-MS（有限水解蛋白质谱）均为基于“蛋白质-配体结合后酶解特性变化”的药物靶点筛选技术。二者在实验逻辑上存在一定相似性，甚至部分研究中将“LiP-MS”称为“DARTS-MS”，导致名称混用和概念混淆。然而，它们在核心原理、技术细节及应用场景上存在较大差异。在研究中，可将DARTS与LiP-MS作为“宏观筛选”与“微观解析”的互补性技术，也可通过协同工作流（LiP-MS→DARTS）兼顾靶标发现与验证。

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作为药物靶点研究的经典技术，DARTS凭借其简便性和经济性在早期药物筛选中发挥了重要作用。尽管新兴技术在多维组学分析深度上更具优势，但DARTS与Western blot联用的靶标验证体系，仍为功能确认提供了高效解决方案。未来，通过优化蛋白酶筛选策略、引入定量质谱技术，DARTS有望进一步提升其在复杂体系中的应用潜力