基于TurboID的邻近标记质谱（PL-MS）实验指南④：实验关键点与疑难解答
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时间：2025-10-13
此前我们学习了TurboID表达系统的构建、稳转细胞系建立以及邻近标记和亲和富集实验等，接下来我们继续学习。本系列我们以CRISPR/Cas9基因编辑技术、TurboID邻近标记方案为例，为研究生提供一套详细、可操作的实验流程。方案将涵盖从POI-TurboID融合表达系统的设计与构建，到稳转细胞系的建立与验证，再到邻近生物素化标记、细胞裂解、链霉亲和素富集以及样品制备用于质谱分析的全过程。通过遵循本方案，研究者有望高效、准确地鉴定其POI在生理条件下的互作蛋白，为深入理解其生物学功能和相关疾病机制提供关键线索。本方案基于编者文献查询及经验总结，不同课题的POI、细胞等条件不一，本文仅提供实验通用条件起步参考，实际课题应根据实验反馈做方法学优化调整。
实验关键点与疑难解答
TurboID邻近标记质谱实验涉及多个环节，任何一步的疏忽都可能影响最终结果的质量。本节总结了实验全流程中的关键控制点、常见问题及其可能的解决方案，旨在提高实验成功率和数据可靠性。
TurboID融合蛋白的表达水平控制
●问题：过高表达可能导致TurboID在细胞内错误定位、形成聚集体、增加非特异性标记 ("overexpression artifacts") 并可能引发细胞毒性；表达过低则导致标记效率不足，信号弱，难以检测到真实的互作蛋白。
●解决方案：
◆首选内源性标记：CRISPR/Cas9介导的内源性基因编辑是控制生理表达水平的最佳策略，能最大限度模拟POI的真实表达情况。
◆诱导性表达系统：对于质粒过表达，强烈建议使用诱导型启动子 (如Tet-On/Off系统)。通过精确调控诱导剂 (如多西环素, Doxycycline) 的浓度和诱导时间，可以精细控制POI-TurboID的表达水平，找到一个既能有效标记又不引起副作用的“最佳窗口”。(May et al., Cells 2020 提及了doxycycline-inducible TurboID expression以控制背景)。
◆筛选合适的单克隆: 在建立稳转细胞系时，通过Western Blot仔细比较不同单克隆中POI-TurboID的表达量，选择表达水平适中 (接近内源POI水平为佳) 且稳定的克隆用于后续实验。避免使用表达量极高或极低的克隆。
◆启动子选择：若使用组成型启动子，可尝试不同强度的启动子 (如强CMV vs. 中等强度EF1α vs. 弱PGK) 来调整表达水平。
背景生物素化水平高
●问题：即使在严格控制的条件下，也可能观察到较高的背景生物素化信号。原因可能包括：(1) 细胞内存在少量天然生物素化的蛋白 (如丙酮酸羧化酶、乙酰辅酶A羧化酶等)；(2) TurboID酶即使在没有外源添加生物素的情况下，也可能存在一定的“泄露 (leakage)”标记活性，利用细胞内源的低浓度生物素进行标记 (May et al., Cells 2020 观察到TurboID在无外源生物素时仍有标记活性)。
●解决方案：
◆严格设置并分析“- Biotin”对照: 这是评估背景生物素化和TurboID泄露活性的基线。在数据分析时，可以将“- Biotin”对照组中鉴定到的蛋白视为背景信号予以扣除或降低其可信度。
◆生物素缺陷培养基预处理 (Biotin-depleted media): 在正式添加外源生物素进行标记前，可将细胞在生物素含量极低或不含生物素的培养基 (通常配合透析处理的胎牛血清) 中预培养一段时间 (如24-48小时)。这有助于耗尽细胞内游离生物素，从而增强后续外源生物素添加后的标记特异性和诱导性，降低背景。(May et al., Cells 2020 讨论了此策略)。
◆优化洗涤条件: 确保亲和富集后的洗涤步骤足够严格、充分，以有效去除与链霉亲和素弱结合的内源性生物素化蛋白或其他非特异性结合蛋白。
◆缩短标记时间: TurboID的优势之一是快速标记。在保证有效标记的前提下，尽量使用最短的标记时间 (如10分钟或更短)，以减少背景累积。
标记半径与非特异性邻近蛋白 (Bystanders)
●问题：TurboID的有效标记半径据估计约为10 nm (Branon et al., Nat Biotechnol 2018)。这意味着除了与POI直接相互作用的蛋白外，仅仅因为空间上靠近 (在标记半径内) 但并非直接结合的蛋白 (即“bystanders”) 也可能被标记。此外，细胞内高丰度的蛋白或本身具有“粘性 (sticky)”的蛋白 (如热休克蛋白、核糖体蛋白) 更容易被非特异性捕获。
●解决方案：
◆设置合理的TurboID-only对照: 如前所述，表达与POI融合形式相同但定位不同的游离TurboID (如TurboID-GFP，或定位于细胞质的TurboID-NES，如果POI是核蛋白) 作为对照。这些对照有助于识别那些因TurboID酶活性本身、高丰度或特定细胞区室普遍存在的背景蛋白。
◆生物信息学过滤与定量分析: 在质谱数据分析阶段，利用蛋白质丰度信息 (如iBAQ, LFQ intensity)、已知的细胞器定位数据库 (如Gene Ontology, CompartmentsDB) 以及公共的“污染物”数据库 (如CRAPome database, www.crapome.org) 来过滤常见的背景蛋白和高丰度“常客”蛋白。通过比较实验组与各对照组中蛋白的富集倍数和统计学显著性 (如p-value, FDR) 来筛选高置信度的候选互作蛋白。
◆正交验证 (Orthogonal validation): 对于筛选出的关键候选互作蛋白，务必通过其他独立的PPI验证方法 (如免疫共沉淀 Co-IP, GST pull-down, 酵母双杂交 Y2H, 荧光共振能量转移 FRET, 邻近连接分析 PLA等) 进行验证，以确认其与POI的真实相互作用。
对照组设置的全面性与重要性
●重要性: 对照组是邻近标记实验的基石，是区分真实生物学信号与实验噪音/假阳性的唯一途径。缺乏合适的对照组或对照组设置不当，会导致结果难以解读甚至得出错误结论。
●推荐的最小对照组合回顾:
❶实验组: POI-TurboID + Biotin
❷ 对照1 (无生物素): POI-TurboID - Biotin
❸对照2 (酶活性/位置对照): 游离TurboID (e.g., TurboID-GFP, 或与POI不同定位的TurboID) + Biotin
❹对照3 (细胞背景): 亲本细胞/空载体细胞 + Biotin
●可选对照：POI突变体-TurboID + Biotin。如果POI有已知的突变体丧失特定互作功能或改变定位，构建相应的突变体-TurboID融合蛋白进行比较，有助于研究特定互作位点或功能域的重要性。
细胞准备细胞裂解条件的优化
●问题：裂解不充分会导致目标蛋白 (特别是位于特定细胞器或复合体中的蛋白) 提取不足，影响后续富集效率；裂解条件过于剧烈 (如过高浓度SDS、过度超声) 则可能破坏真实的蛋白相互作用或导致蛋白降解、变性。
●解决方案：根据POI的亚细胞定位 (胞浆、核内、膜蛋白、特定细胞器如线粒体/内质网) 和预期的互作稳定性，选择和优化裂解液的去污剂类型和浓度、盐浓度、以及是否需要超声和超声参数。例如，对于膜蛋白或紧密结合的蛋白复合体，可能需要更强的去污剂或多次超声。预实验中可通过Western Blot检测POI的释放情况来评估裂解效率。
亲和富集后洗涤条件的优化
●问题：洗涤不足导致大量非特异性结合蛋白残留，掩盖真实的低丰度互作蛋白，增加质谱分析的复杂性和背景噪音；洗涤过度则可能丢失丰度较低或结合较弱的真实互作蛋白。
●解决方案：这是一个需要仔细摸索的平衡点。可以尝试不同强度和组合的洗涤缓冲液 (如改变盐浓度、去污剂种类和浓度、添加少量有机溶剂或变性剂如低浓度尿素)，并通过Western Blot检测已知互作蛋白 (如果存在阳性对照) 和常见背景蛋白 (如Actin, Tubulin, HSPs) 在洗涤过程中的残留情况来优化洗涤方案。目标是最大限度去除背景，同时保留真实信号。
质谱数据的生物信息学分析
●关键：质谱原始数据的处理、肽段和蛋白质的鉴定、以及后续的定量和统计分析对于从海量数据中筛选出高置信度的候选互作蛋白至关重要。
●常用策略：
◆使用专门的蛋白质组学数据分析软件 (如MaxQuant, Proteome Discoverer, Spectronaut等) 进行肽段鉴定和定量。
◆利用专门为PL数据设计的统计分析工具或流程 (如SAINT (Significance Analysis of INTeractome), Perseus等) 进行背景扣除和显著性分析。这些工具通常会整合来自多个对照组的数据，计算每个鉴定到蛋白的富集倍数和统计学置信度。
◆进行功能富集分析 (如GO, KEGG pathway) 和蛋白互作网络构建 (如STRING DB, Cytoscape)，以从生物学角度解读筛选出的候选互作蛋白列表。
(Cho et al., Nat Protoc 2020 提及了蛋白组学数据分析的通用流程和注意事项)。
总而言之，成功的TurboID-PL-MS实验依赖于：
◆精心设计的POI-TurboID融合构建体和表达策略。
◆经过充分验证的、表达水平适宜的稳转细胞系。
◆严格且全面的对照组设置。
◆优化的生物素标记、细胞裂解和亲和富集条件。
◆细致的洗涤步骤以最大限度降低背景。
◆审慎可靠的质谱分析和生物信息学数据处理。
◆对关键发现进行独立的正交验证。
总结与展望
基于TurboID的邻近标记质谱 (PL-MS) 技术，凭借其高催化效率和短标记时间的独特优势，已成为研究蛋白质-蛋白质相互作用 (PPIs)，特别是捕获细胞内动态、瞬时及弱相互作用的强大工具。本实验方案详细介绍了从利用CRISPR/Cas9技术构建内源性POI-TurboID融合表达细胞模型，到稳转细胞系的建立与验证，再到具体的邻近标记、样品处理、亲和富集以及质谱样品制备的全过程。我们强调了在实验设计中严格设置对照组、细致优化各项实验操作参数以及审慎进行数据分析对于获得可靠且具有生物学意义结果的极端重要性。
谱度众合针对PL-MS实验开发了PL-MS蛋白临近表达筛选解决方案，为客户提供从细胞构建培养、亲和富集实验到质谱高通量筛选的一站式服务（阶段可选）。如果您觉得PL-MS实验繁琐、不确定性强，或是周期紧张，您可以交由谱度众合来完成。最终报告涵盖高可信度候选互作蛋白清单、候选互作蛋白注释富集分析、蛋白互作数据库挖掘、蛋白相互作用网络构建、互作网络关键节点筛选以及不同背景条件下互作蛋白结合强弱的动态分析等。
谱度众合是一家由武汉大学博士团队创办的科研服务企业，我们专注于利用质谱技术服务于生物标志物、药物靶点筛选、基础研究等蛋白质研究领域，我们在本专业细分领域持续深耕十几年，针对具体研究场景开发多种面向具体研究目的和论文发表需求的服务产品，助力于客户更轻松更高效的完成科研目标。
参考文献
◆Branon, T.C., Bosch, J.A., Sanchez, A.D., Udeshi, N.D., Svinkina, T., Carr, S.A., Feldman, J.L., Perrimon, N., & Ting, A.Y. (2018). Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology, 36(9), 880–887. PMID: 30125270; PMCID: PMC6126969.
◆Cho, K.F., Branon, T.C., Udeshi, N.D., Myers, S.A., Carr, S.A., & Ting, A.Y. (2020). Proximity labeling in mammalian cells with TurboID and split-TurboID. Nature Protocols, 15(12), 3971–3999. PMID: 33139955. (Link: https://www.nature.com/articles/s41596-020-0399-0)
◆May, D.G., Scott, K.L., Wood, C., Yi, Z., Berger, A., Zimdars, J.L., ... & Roux, K.J. (2020). Comparative Application of BioID and TurboID for Protein-Proximity Labeling in Human Cells. Journal of Proteome Research, 19(6), 2569–2582. PMID: 32344865; PMCID: PMC7290721.
◆Uçkun, E., Wolfstetter, G., Fuchs, J., & Palmer, R.H. (2022). In vivo Characterization of Endogenous Protein Interactomes in Drosophila Larval Brain, Using a CRISPR/Cas9-based Strategy and BioID-based Proximity Labeling. Bio-protocol, 12(13), e4458. DOI: 10.21769/BioProtoc.4458. (Link: https://en.bio-protocol.org/pdf/Bio-protocol4458.pdf)
◆Cell Press. (2024). Leveraging a self-cleaving peptide for tailored control in proximity-dependent biotinylation. Cell Reports Methods. (Reference to S2667-2375(24)00183-8, specific article details depend on full publication, link from search: https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(24)00183-8)
◆ScienceDirect. (Year N/A). A TurboID-based proximity labelling approach for identifying the DNA... (Reference to S2666166723000977, specific article details depend on full publication, link from search: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666166723000977)
◆Novopro.cn. pCMV-TurboID-3×FLAG-Neo 载体图谱和序列. (Link: https://www.novopro.cn/vector/Vge4danju)
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◆Lonza. Guideline for Generation of Stable Cell Lines. (Link from search: https://knowledge.lonza.com/downloadasset.ashx?assetId=28243)
◆ScienceDirect. (Year N/A). A proximity labeling protocol to probe proximity interactions in... (Reference to S2666166721006924, specific article details depend on full publication, link from search: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666166721006924)
