内源性蛋白质相互作用研究工具——高特异性、高亲和力Strep Pull Down实验指南①—strep标签精准插入
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时间：2025-10-14
高通量筛选相互作用蛋白的实验方法通常有IP-MS、Pull down、PL-MS等，在没有高质量抗体情况下，研究内源性的蛋白质相互作用，strep pull down是为数不多的选择之一。Strep-tag系统，特别是其第二代Strep-tag II (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) 及其串联形式Twin-Strep-tag®，因其与工程改造的链霉亲和素Strep-Tactin®之间具有高亲和力（Twin-Strep-tag®可达pM级别）和高特异性结合，已成为蛋白质纯化和PPI研究非常好用的工具。(Nature Protocols, 2007)。
本文旨在为从事蛋白质相互作用研究的研究者提供一份详尽的实验指南，系统阐述如何从利用基因编辑技术构建表达内源性Strep标签融合蛋白的细胞系开始，到实施Strep Pull Down亲和纯化，最终通过质谱技术鉴定相互作用蛋白的完整实验流程、关键技术细节及注意事项。
一、利用基因编辑技术实现内源性Strep标签的精准插入
本阶段的核心目标是在目标基因的编码序列（Coding Sequence, CDS）的特定末端（通常是N-末端或C-末端）通过基因编辑技术，精准地插入Strep-tag编码序列。这样可以使细胞在生理条件下表达带有Strep标签的内源性融合蛋白，最大程度地保留其天然的表达调控模式、亚细胞定位以及参与蛋白质相互作用的能力。
当前实现内源性基因编辑和标签插入最主流的技术是CRISPR/Cas9系统介导的同源重组（Homology-Directed Repair, HDR）。
CRISPR/Cas9系统介导的同源重组（HDR）：
●工作机制：Cas9核酸酶在sgRNA（single guide RNA）的引导下，特异性地识别并切割基因组DNA上的目标位点，产生DNA双链断裂（Double-Strand Break, DSB）。在细胞内存在DSB时，细胞会启动修复机制。如果此时外源提供一个修复模板（donor template），该模板两端包含与DSB位点两侧序列同源的“同源臂”（homology arms），中间则包含Strep-tag的编码序列（以及可能的筛选标记或Linker序列），细胞则可能通过HDR途径，利用该模板进行修复，从而将Strep-tag序列精确地整合到基因组的目标基因位点 (PubMed, 2019; CRISPR/Cas9-Mediated Gene Tagging)。
●优势：能够实现对内源性基因的精确编辑和标记，避免了传统过表达系统可能导致的蛋白质错误定位、异常聚集或非生理性相互作用等问题。
Strep-tag的选择与设计：
●标签类型：常用的有Strep-tag II (序列为WSHPQFEK) 和Twin-Strep-tag®。Twin-Strep-tag®由两个Strep-tag II序列通过一个短的连接肽（linker）串联而成，与Strep-Tactin®的亲和力远高于单个Strep-tag II，因此在Pull Down实验中具有更高的捕获效率和更低的背景（Twin-Strep-tag application）。
●插入位置：可以选择在目标蛋白的N-末端或C-末端插入标签。选择依据主要是评估标签对目标蛋白正确折叠、亚细胞定位、翻译后修饰以及生物学功能的影响。通常情况先N端，N端不表达再做C端。对于比较难表达和蛋白太小容易被降解的蛋白，可以加在N端，可以保证蛋白的稳定性，同时不会对外源蛋白免疫原性造成较大影响，适用于表位筛选。如果搭建的是分泌蛋白，装在N端，蛋白N端的信号肽会被酶切掉，这个时候适合加在C端。
●Linker序列：（可选）在目标蛋白编码序列与Strep-tag编码序列之间加入一段柔性Linker序列（如多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复，即(GGGGS)n）。Linker有助于减少标签对目标蛋白天然构象的潜在空间位阻干扰，使其各自能独立正确折叠并发挥功能。通常可以先尝试不加linker，一般不会影响蛋白的表达。
●考虑因素：设计时需确保Strep-tag的插入不会破坏目标蛋白已知的关键功能结构域、重要的翻译后修饰位点或信号肽等。同时要确保标签序列与目标基因的读码框正确对应。
❶ sgRNA设计与验证：
●选择切割位点：在目标基因CDS的N-端起始密码子之后或C-端终止密码子之前选择合适的Cas9切割位点。理想的切割位点应尽可能靠近计划插入标签的位置，以提高HDR效率。
●sgRNA设计：优先选择文献报道的序列。如果没有找到合适的序列，利用在线生物信息学工具（https://crispor.gi.ucsc.edu/）设计sgRNA序列。设计时需综合评估其预测的切割效率（on-target score）和脱靶可能性（off-target score）。通常选择2-3条高分sgRNA进行后续验证。
●sgRNA验证：通过体外切割实验（如用Cas9蛋白和体外转录的sgRNA切割PCR产物）或在细胞内通过T7E1/Surveyor实验、Sanger测序分析indel频率等方法，验证sgRNA的实际切割效率。
❷ 同源重组修复模板（Donor Template）设计与构建：
●结构组成：典型的修复模板（通常为质粒形式或长单链DNA (ssODN)）应包含以下元件：5'同源臂 - (可选Linker序列) - Strep-tag编码序列 - (可选Linker序列) - (可选：筛选标记基因如Puromycin抗性基因，其后可连接自剪切肽如P2A/T2A或内部核糖体进入位点IRES，以实现与目标蛋白的共表达) - 3'同源臂。详细的CRISPR KI方案可参考STAR Protocols, 2024。
●同源臂长度：为提高HDR效率，两侧同源臂的长度通常建议在400-800 bp之间。对于ssODN模板，同源臂可以更短，例如每侧40-100 nt。
●Strep-tag序列：确保插入的Strep-tag编码序列与目标基因的读码框一致。
●构建方法：同源臂可从细胞基因组DNA中PCR扩增。Strep-tag序列和Linker序列可通过基因合成或引物包含方式引入。然后通过无缝克隆或酶切连接方法将这些片段组装到合适的质粒载体上。对于小片段插入（如单个Strep-tag），直接使用化学合成的长ssODN作为修复模板也是一种高效的选择 (Nature Communications, 2016; A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging)。
❸ 细胞转染/电穿孔：
●将编码Cas9的质粒（或直接使用Cas9蛋白/mRNA）、表达sgRNA的质粒（或体外转录的sgRNA）以及修复模板共转染或电穿孔导入目标哺乳动物细胞。
●根据细胞类型优化转染/电穿孔参数，以平衡转染效率和细胞存活率。例如，对于难转染细胞，电穿孔通常比脂质体转染效率更高。
●提高HDR效率：HDR是细胞内相对低效的修复途径。可通过以下方法尝试提高效率：
◆细胞周期同步：HDR主要发生在S期和G2/M期，可使用药物（如Nocodazole, Thymidine）将细胞同步化。
◆使用HDR增强剂：某些小分子化合物（如SCR7, RS-1, L755507）据报道可以抑制非同源性末端接合（NHEJ）或增强HDR活性。
◆优化递送方式和比例：优化Cas9、sgRNA和修复模板的递送方式（如RNP复合物）和摩尔比例。
●脱靶效应评估与最小化：CRISPR/Cas9系统可能在基因组非目标位点（脱靶位点）引入突变。应通过生物信息学工具预测潜在脱靶位点，并对筛选到的阳性克隆在这些位点进行测序验证。使用高保真Cas9或优化sgRNA设计可降低脱靶风险。
●评估标签对蛋白功能的影响：在成功获得Strep标签融合蛋白的细胞系后，必须验证融合蛋白的表达水平、亚细胞定位以及关键的生物学功能是否与野生型蛋白一致，确保标签的引入未显著干扰蛋白的正常生理活动。
●筛选标记的使用与去除：若在修复模板中加入了抗性筛选标记，需考虑其对细胞生理或后续实验的潜在影响。可以设计在筛选标记两侧引入LoxP位点，在获得阳性克隆后，通过瞬时表达Cre重组酶将其去除。
关键要点
通过CRISPR/Cas9介导的HDR，将Strep-tag（优选Twin-Strep-tag®以提高亲和力）精准插入目标基因的内源性位点。关键在于高效sgRNA的设计与验证、高质量修复模板的构建（包含合适的同源臂和Linker），以及优化细胞递送和HDR效率的策略。务必评估标签对蛋白功能的影响并注意脱靶效应。
由于完整的Strep Pulldown实验指南篇幅过长，我打算分多篇文章发布，接下来我将学习稳转细胞系的建立。另外Strep Pulldown实验的具体步骤以及实验难点和常见解决办法我也将在接下来几篇内容中整理，欢迎持续关注！
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