内源性蛋白质相互作用研究工具——高特异性、高亲和力Strep Pull Down实验指南②—表达系统构建
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时间：2025-10-15
Strep-tag系统因其与Strep-Tactin®之间的高亲和力（Twin-Strep-tag®可达pM级别）和高特异性结合，已成为蛋白质纯化和PPI研究非常好用的工具。本文旨在为研究者提供一份详尽的strep pull down实验指南，此前我们学习利用基因编辑技术实现内源性Strep标签的精准插入，我们接着学习！
二、稳定表达Strep标签融合蛋白细胞系的构建与筛选
在成功将Strep-tag序列通过基因编辑导入细胞后，本阶段的核心目标是从混合细胞群体中筛选、分离并鉴定出那些已正确将Strep-tag整合到目标基因组位点，并且能够稳定表达功能正常的Strep标签融合蛋白的单克隆细胞系。
首先，如果修复模板中包含了选择性标记（如抗生素抗性基因），则可以通过药物筛选富集成功整合了外源DNA的细胞。其次，通过物理方法（如有限稀释法或流式细胞术分选）将单个细胞分离培养，使其形成克隆。最后，对这些单克隆进行分子生物学和生物化学分析，以确认基因型的正确性（标签是否精确插入）和表型的预期性（融合蛋白是否正确表达和定位）。
❶ 药物筛选（如适用）：
●转染/电穿孔后24-48小时，当细胞恢复正常生长状态后，开始在培养基中加入适当浓度的筛选药物（如Puromycin, G418, Hygromycin B等，取决于修复模板中携带的抗性基因）。
●筛选药物的最佳浓度需要预先通过构建“杀灭曲线”（kill curve）来确定，即找到能在7-10天内杀死所有未转染亲本细胞的最低药物浓度。
●持续进行药物筛选，定期更换含药培养基，直至出现离散的抗性细胞克隆。此过程通常需要1-3周。可参考Lonza提供的稳定细胞系构建指南 (Lonza Guideline for Generation of Stable Cell Lines)。
❷ 单克隆细胞的获取：
●有限稀释法（Limiting Dilution Cloning）：将经过药物筛选后存活的细胞（或未经筛选的细胞，如果HDR效率较高或修复模板未包含筛选标记）消化、重悬并进行系列稀释。将细胞悬液以极低的密度（如理论上每孔0.3-0.5个细胞）接种到96孔板中。培养数天至数周，待单个细胞生长形成清晰可见的克隆。
●流式细胞术分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）：如果Strep-tag与荧光报告蛋白（如GFP, mCherry）通过P2A肽或IRES元件共表达，或者修复模板本身包含荧光标记，则可以通过FACS将表达荧光蛋白的单个细胞直接分选到96孔板的单个孔中进行培养。这种方法效率更高，且能预先筛选表达阳性的细胞。
●其他方法：如克隆环挑取、半固体培养基克隆等也可根据实验室条件选用。
❸ 单克隆细胞的扩增与鉴定：
●将96孔板中形成的单克隆细胞逐步从96孔板扩增至24孔板、6孔板，最终到培养皿或培养瓶，同时冻存备份。
●基因组DNA提取与PCR鉴定：从每个单克隆细胞中提取基因组DNA。设计两套或多套PCR引物进行鉴定：一套引物分别位于插入位点某一侧同源臂的外部区域和Strep-tag序列内部，用于检测是否存在正确的5'或3'端整合；另一套引物跨越整个插入区域，用于确认插入片段的大小和完整性。与野生型细胞对照，阳性克隆应能扩增出预期大小的特异性条带。
●Sanger测序：对上述PCR鉴定阳性的产物进行Sanger测序，以精确验证Strep-tag序列是否正确无误，插入位点是否准确，以及连接处有无发生非预期的插入、缺失或突变（indel）。这是确保基因编辑精确性的金标准。
●Western Blot检测融合蛋白表达：
◆制备单克隆细胞裂解液，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转移至PVDF膜。
◆使用高质量的抗Strep-tag抗体（如StrepMAB-Classic）检测Strep标签融合蛋白的表达。确认其分子量是否与预期一致（目标蛋白分子量 + Strep-tag及Linker分子量）。
◆如果目标蛋白有特异性抗体，也可用其进行检测，比较融合蛋白与内源性野生型蛋白的表达水平和分子量差异。
●免疫荧光（Immunofluorescence, IF）（可选）：通过抗Strep-tag抗体或针对目标蛋白的抗体进行免疫荧光染色，观察Strep标签融合蛋白在细胞内的亚细胞定位是否与已知的野生型蛋白定位一致。这有助于判断标签的引入是否影响了蛋白质的正确靶向。
●详细的克隆验证步骤可参考STAR Protocols, 2024 (克隆验证部分)。
●克隆纯度保证：通过有限稀释法或FACS获得的单克隆，有时可能并非真正的单细胞来源，或者在早期培养过程中发生交叉污染。为确保克隆的纯合性，建议对初筛阳性的克隆进行第二轮单克隆化（subcloning）。
●提高单细胞存活率：单个细胞在96孔板中培养时条件较为苛刻，存活率可能较低。可以尝试使用条件培养基（即用亲本细胞培养过一段时间的培养基，过滤后使用，富含细胞因子）、添加特定的生长因子或饲养层细胞（feeder cells）来提高单克隆的形成效率。
●表达均一性与稳定性筛选：不同单克隆之间，即使基因型正确，Strep标签融合蛋白的表达水平也可能因整合位点周围染色质环境的“位置效应”而存在显著差异。应选择那些融合蛋白表达水平适中（接近内源水平为佳）、生长状态良好且在连续传代培养过程中表达稳定的克隆用于后续实验。
●长期培养与冻存：一旦获得经过充分验证的阳性单克隆细胞系，应尽早进行大规模扩增并制备足够数量的高质量细胞冻存种子库，以避免因长期培养可能导致的表达丢失、基因沉默或发生其他突变。定期复苏细胞并检测融合蛋白的表达情况。
关键要点
稳定细胞系的构建是确保后续Pull Down实验可靠性的基石。核心在于通过药物筛选（如果适用）和单克隆分离技术（如有限稀释法）获得候选克隆，并通过严格的基因型（PCR、测序）和表型（Western Blot、IF）鉴定，筛选出Strep-tag正确插入、融合蛋白表达正常且定位正确的纯合单克隆细胞系。
由于完整的Strep Pulldown实验指南篇幅过长，我打算分多篇文章发布，接下来我将学习pulldown实验。另外Strep Pulldown实验难点和常见解决办法我也将在接下来几篇内容中整理，欢迎持续关注！
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