前言

今天带来一篇2019年发表在Investigative Ophthalmology & Visual Science（IF=4.799）上的文章，文章标题为使用环孢素A与地喹福索四钠局部治疗干眼症后人类泪液蛋白质组的变化。这篇文章突出了蛋白质组学在随机对照临床试验中的应用。

干眼症（DED）是一种由多种因素引起的、以眼睛干涩为主要症状的泪液分泌障碍性眼病。其发病机制为泪膜不稳定，泪液高渗压，眼表炎症。目前，轻度DED的治疗手段为使用人工泪液、自体血清补充水分；中重度DED使用局部消炎剂如环孢素A（CsA）0.05%或促泌剂如地喹福索四钠（DQS）3%。CsA和DQS两种药物表现出不同的作用机制，但目前并没有根据患者类型推荐哪种药物更有效的研究结果，也缺乏评估DED治疗效果以及疾病严重程度的适当生物标记物。

本文旨在探究使用CsA和DQS处理后人眼泪中蛋白质组的变化，以及寻找影响疾病严重程度和治疗效果的生物标志物。

· 概 / 览 ·

实验设计：随机对照试验，评估者蒙面。

基线资料：18位患者治疗前临床指标，DED严重程度相当。

作者共纳入 18 名非干燥综合征DED患者，每组 9 名患者。分别接受 4 周的局部 CsA 0.05% 或 DQS 3% 治疗。在评估泪液破裂时间、角膜和结膜侵蚀染色以及治疗前后的泪液分泌实验结果后收集泪液样本。使用非标记定量的方法检测泪液蛋白质组，倍数变化 > 1.5 或 <0.67 (P < 0.05) 的蛋白质被认为是差异表达蛋白 (DEP)。

作者分析了接受不同治疗方案的 DED 患者的泪液蛋白质组，发现与临床结果相关的分子途径在 DQS 和 CsA 治疗之间存在显著差异。泪液蛋白质组学分析有助于深入理解 DED 中眼表的变化。

结果一：CsA与DQS治疗临床效果比较

经过4周治疗，多项指标如眼表疾病指数、泪膜破裂时间、泪液分泌情况等得到显著改善，两种药物的药效没有明显区别。

结果二：治疗前后 DED 泪液的蛋白质组学分析

每组9名受试者，收集治疗前和治疗后的泪液，每3个人的泪液蛋白合并收集后进行溶液内酶解，使用LFQ定量方法进行分析。差异蛋白筛选标准为Fold change>1.5 且 P<0.05。

两组治疗前样本显示出较小的差异；DQS处理后样本与其他样本聚类显示出最高差异；CsA处理后介于中间。

结果三：治疗前后泪液的蛋白差异表达及功能分析

CsA 治疗后， 26 种蛋白质显著上调和 28 种蛋白质显著下调；DQS 治疗后，51 种蛋白质显著上调和 55 种蛋白质显著下调。

通过GO分析，作者发现在GO biological process中，CsA治疗后上调蛋白富集通路包括：过氧化氢分解代谢、囊泡介导的转运、防御反应、免疫反应和细胞死亡的调节；CsA治疗后下调蛋白富集通路包括：防御反应和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联；DQS治疗后上调蛋白富集通路与CsA治疗后相似；DQS治疗后下调蛋白富集通路包括：MAPK级联、补体激活和脂质转运。在GO molecular function中，CsA治疗后上调蛋白富集通路:过氧化物酶/磷酸化酶/肽酶活性、MHC I类结合和糖胺聚糖结合；CsA治疗后下调蛋白富集通路包括：肽酶抑制剂活性和钙相关结合；DQS治疗后上调蛋白富集通路包括：钙离子和脂质结合、酶活性和糖蛋白结合；DQS治疗后下调蛋白富集通路包括：丝氨酸型内肽酶活性、细胞粘附和分子伴侣结合。

结果四：治疗前后泪液的蛋白互作网络差异

两种药物的共性包括炎症相关、细胞死亡和上皮发育调节的互作网络，DQS治疗组还涉及脂质代谢和细胞粘附。

结果五：CsA 和 DQS 处理之间蛋白质表达模式的比较

在 22 种蛋白质中观察到 CsA 或 DQS 治疗后的变化相同。GOBP 分析表明，两种治疗后下调的蛋白质（n = 13）富集在葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞粘附，上调的蛋白质（n = 9）富集在氧转运、防御反应，和细胞死亡的调节。

49 种蛋白质在 CsA 或 DQS 治疗后变化相反，其中与调节内肽酶活性、蛋白质代谢和伤口愈合相关的蛋白质在 CsA 治疗后的泪液中上调，而在 DQS 治疗后下调。参与调节应激反应、组织稳态和防御反应的蛋白质在DQS 治疗后上调。 

· 结 / 论 ·

CsA 或 DQS两种疗法都增强了先天性和适应性免疫反应以及细胞解毒。基于非标记定量的差异蛋白的分析为深入了解DED患者眼表的广泛变化提供了依据。尽管两种药物都改善了临床参数，但两种治疗方法之间激活的泪液特异性生物标记物存在显著差异。蛋白质互作网络分析表明，治疗过程中差异蛋白主要与炎症相关。

同时，本文也存在一定的局限性，如样本量小，且对样本进行了合并可能导致信息的丢失，且由于样本量的限制无法区分疾病亚型；没有进行验证实验；两种药物治疗建议有所不同，可比性不足等。

· 总 / 结 ·

本文是一篇结合随机对照试验设计和蛋白质组学分析的文章，由两个核心的实验结果组成：治疗效果的临床指标评价、蛋白质组学分析。

随机对照试验原则包括随机化原则、设立对照组、盲法原则和前瞻性。本研究采用分层置换区组随机化进行随机分组，并对药品重新包装对患者采用盲法，且是第一项探究使用局部药物治疗的泪液蛋白质组变化的研究。

本研究表明，以临床样本为材料进行蛋白质组学检测并结合生物信息学分析可以探究疾病相关的分子机理和内在规律。蛋白质组学和随机对照试验结合可发现用于评估疾病疗效及严重程度的生物标记物。