前言

今天带来一篇2019年发表在The American Journal of Pathology（IF=4.307）上的文章，文章标题为《傅里叶变换红外成像和蛋白质组学相结合鉴定膀胱癌候选组织化学生物标志物》。这篇文章突出了蛋白质组学在横断面研究中的应用。

膀胱癌是常见的泌尿生殖道恶性肿瘤。新发患者中，约70%至75%为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），多数为低级别膀胱癌，膀胱原位癌（CIS）虽然属于NMIBC，但通常分化差，属于高级别恶性肿瘤；25%至30%为肌层浸润（MIBC）的高级别膀胱癌，10%的病例出现转移。膀胱癌的预后取决于其分期和分级，但目前没有特异性较高的生物标志物。诊断及肿瘤分级分期仍然依靠基于活检的影像评分，这在不同观察者之间存在差异。

目前，由急或慢性膀胱炎或CIS的卡介苗（BCG）灌注诱导的炎症引起的反应性尿路上皮异型（RUA）、CIS与其他NMIBC、低侵袭性与高侵袭性肿瘤往往难以明确区分。之前研究中建议将CD44、p53、CK20三种由蛋白质组学筛选出的候选标志物联合使用进行免疫组化染色辅助诊断，但这对染色的判别来说是很大的挑战。

本文旨在找到一种高敏感性和特异性的生物标记物来区分不同亚型膀胱癌诊断中的病理结果，以及区分良恶性扁平尿路上皮病变。

· 概 / 览 ·

实验设计：横断面研究

作者共使用5个样本集。首先使用11例患者的冷冻手术样本，通过傅里叶变换红外（FTIR）成像的新方法区分了膀胱癌中的组织，并通过103例样本进行了验证。随后联合激光显微切割收集确定的肿瘤区域，为蛋白质组分析提供均质样本，对17例膀胱炎和浸润性高级别尿路上皮癌样本进行了分析。通过定量蛋白质组学筛选出三个候选生物标记物后，使用60例样本通过免疫组织化学进行验证。最后在310例样本的较大队列中评估了效果最好的候选生物标记物，可以区分急性或慢性膀胱炎中的RUA和非肌层浸润性CIS。

本文发现AHNAK2 可能是一种有用的 IHC 候选生物标志物，可在难以区分膀胱癌亚型的情况下用作免疫组化标志物辅助诊断。本文描述的 FTIR 成像方法实现了膀胱癌组织精准分类，为基于蛋白质组学的分析精确选择癌组织。

结果一：FTIR引导激光捕获显微切割

基于随机森林算法的模型对组织进行分类，与H&E染色图像（病理学家注释）进行比较，其特异性为95%，敏感性为95%，准确性为95%。

这证明了通过 FTIR 成像对组织类型进行无标记分类的有效性。

结果二：激光捕获显微切割组织样品的定量蛋白质组学分析

作者使用非标记定量（LFQ）的方法，在17个样本（10个浸润性高级别膀胱癌样本，7个膀胱炎样本）中共鉴定到3515个蛋白质，定量到2481个蛋白质，其中1739个蛋白质含有unique peptide。以adjusted P≤ 0.05, 绝对比值≥ 1.5为标准，共筛选出有74种差异蛋白质，其中62个在膀胱炎样本中含量较高，12个在浸润性高级别膀胱癌样本中含量较高。

结果三：候选生物标记物的选择

接下来，作者对浸润性高级别肿瘤样本中含量显著较高的12种蛋白质作为潜在生物标记物进行了更详细的分析。进一步通过筛选ratio of means 以及蛋白与膀胱癌的关联性选择了AHNAK2， KRT6A和ASPN作为潜在诊断标志物。

结果四：IHC验证

作者随后使用IHC对差异蛋白中的3种候选标志物进行了验证。结果显示只有AHNAK2表达在膀胱炎上皮组织、结缔组织、低级别膀胱癌细胞、浸润性高级别膀胱癌细胞中存在显著差异。绘制ROC曲线以评估标志物的敏感性（真阳性率）和特异性（真阴性率）之间的关系。对于AHNAK2（0.87），膀胱炎和浸润性高级别膀胱癌之间的比较曲线下的最大面积为75%，特异性为95%。

使用包括严重膀胱炎伴RUA、非CIS 的浸润性高级别膀胱癌、CIS、低级别膀胱癌患者队列的 FFPE 组织样本对AHNAK2进一步验证，结果显示AHNAK2可以区分急性或慢性膀胱炎中的RUA和非肌层浸润性CIS。

· 结 / 论 ·

本文使用FTIR成像方法，对膀胱癌的组织分类具有高灵敏度和特异性，可以引导激光捕获显微切割精确选择癌组织进行基于蛋白质组学的定量分析。通过基于LC-MS的非标记定量筛选出的AHNAK2，可以区分急性或慢性膀胱炎中的RUA和非肌层浸润性CIS。

本文也存在一定局限性，如仅在表达量上对潜在标志物进行了验证，但未进行针对标志物的机理研究；本研究非多中心研究，证据力度不如病例对照和队列研究。

· 总 / 结 ·

本文是一篇结合横断面研究设计和蛋白质组学分析的文章，使用了多样本集进行训练和验证。主要实验结果包括FTIR成像方法的有效使用、差异蛋白的筛选和候选标志物的IHC验证。

横断面研究可以在特定时间内研究特定范围的人群中疾病或健康状况的分布，描述有关因素与疾病之间的关系，客观反映了某一时间点的疾病分布及暴露因素与疾病的关联。其优点在于低成本，可同时观察多种因素；样本的代表性往往较强，研究所得结果也就具有较好的概括性；时效性比较强，可以较快获得研究结果，同时避免了失访等情况出现。其局限性在于组群之间的可比性；暴露和结局无时序性，不能反应因果关系等。

诊断是疾病治疗、预后的前提，诊断试验可以为疾病诊断提供依据，掌握科学的研究和评价方法可为选择合理的诊断方法奠定基础，同时可避免单凭经验造成的错误。对于诊断性试验来说，常用来评价研究结果重要性的指标包括敏感度、特异度、准确度、患病率、阳性预测值、阳性似然比等。

本研究在蛋白质组学的分析上可以进行进一步的完善，例如对差异蛋白进行生物信息学分析，以提示疾病发生机制；优化蛋白筛选的条件，建立更精准有效的诊断模型等。

本研究表明，蛋白质组学和横断面研究结合可以发现新的疾病诊断标志物，对疾病亚型进行鉴别诊断。