前言

世界卫生组织国际癌症研究署（IARC）发布的全球癌症负担数据表明，2020年全球新增肺癌确诊病例220万（仅次于乳腺癌），新增肺癌死亡病例180万（远超其他癌症）。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的一种类型，占所有肺癌病例的85%，而NSCLC患者中有30-50%会在肺癌晚期出现脑转移，且预后极差（中位生存期：4-6个月）。预后不良的主要原因之一就是缺乏早期检测肺癌脑转移的方法。

目前，脑转移的诊断主要基于对活检或手术切除获得样本的组织病理学分析。然而，这是一个高度侵入性的过程，并且在患者已经出现脑转移症状后才会进行相关检测。对于II-IV期NSCLC患者，临床上一般采用脑部核磁共振成像（MRI）来检测脑转移，然而NSCLC病程较长，MRI长期检测所需要的成本较高且预测能力较低，故其推广使用受到限制。此外，MRI扫描依赖于血脑屏障的损伤，这种损伤多发于疾病进展较晚的阶段，限制了MRI在早期诊断中的应用。因此，开发一种更敏感、更特异和低侵入性的脑转移诊断方法成为当务之急。

近日，由大连医科大学第二医院和首都医科大学北京胸科医院合作发表在British Journal of Cancer上题为Cathepsin F and Fibulin-1 as novel diagnostic biomarkers for brain metastasis of non-small cell lung cancer的文章表明，血清组织蛋白酶F（CTSF）和纤维蛋白-1（FBLN1）可以作为NSCLC脑转移的生物标志物，具有早期诊断及预后评估的作用。

实验设计

本研究构建了NSCLC脑转移的小鼠模型，并将纳入研究的人群分为4个队列，分别为包含80例患者血清样本的发现队列1、包含459例患者血清样本的验证队列2、包含76例患者组织样本的验证队列3和包含160例患者血清样本的模型确证队列。通过对小鼠模型样本进行定量蛋白质组学检测，作者从原发性癌细胞和脑转移肿瘤细胞间的差异蛋白中初步筛选出10个候选的蛋白分子标志物，之后通过队列1的ELISA检测将候选标志物数量减低至3个，并分别在队列2和队列3中进行了验证。将队列2作为训练集，作者通过逻辑回归算法构建了诊断预测NSCLC脑转移的血清蛋白标志物组合模型，在队列4中对建立的临床模型进行了检验。此外，作者还对队列2和队列3的部分患者进行了随访，分析检验了筛选出的分子标志物用于检测治疗效果及预测患者预后生存率的性能。

图1  研究设计的示意图。LCBM：非小细胞肺癌脑转移；LM：单器官肝转移；BoM：单器官骨转移；ALC：晚期非小细胞肺癌无远处器官转移；ELC：早期非小细胞肺癌；PBT：原发性脑肿瘤；HG：健康人。

结果一：CTSF和FBLN1可作为NSCLC脑转移的潜在生物标志物

通过造模成功小鼠中脑转移组织细胞和原代肺癌细胞间的定量蛋白质组学比较，筛选得到773个表达上调和587个表达下调的差异蛋白。根据表达上调的程度以及既往研究中报告，作者重点关注了10个蛋白质（CTSF、FBLN1、AKR1B10、CCL20、SAA1、CXCL1、CXCL3、AXL、AKR1C3、CPNE3）。

接下来在包含80例患者血清样本的队列1中，作者使用ELISA方法测定各组血清中这10个蛋白的表达量。如图2d所示，与其他三个对照组相比，LCBM（脑转移）组CTSF、FBLN1、AKR1B10的表达量显著增加，因此作者将研究目标锁定在这3个蛋白上。

然后，作者分别采用ELISA方法或IHC方法在包含459例患者血清样本的验证队列2和包含76例患者组织样本的验证队列3中对这3个蛋白的表达了进行了验证。图2e-g显示了队列2的验证结果：与其他六个对照组相比，LCBM组CTSF和FBLN1的表达显著上调，而AKR1B10在LCBM组、LM组、BoM组和ALC组之间的表达差异不具有统计学意义，表明CTSF和FBLN1有区分NSCLC脑转移和其它亚型的能力，可作为NSCLC脑转移的潜在生物标志物，而AKR1B10无法区分晚期NSCLC患者是否出现脑转移。

图2  候选蛋白质筛选结果。a：质量控制样品的相对标准偏差分布；b：与亲代PC9相比，PC9-BrM3的蛋白质表达谱；c：火山图筛选差异蛋白；d：队列1的每个临床组中10种候选蛋白的血清水平；e-g：队列2的每个临床组中CTSF、FBLN1和AKR1B10的血清水平；每个点对应一个个体，数据以平均值±标准差表示；*P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。

图3  组织中CTSF、FBLN1和AKR1B10的表达。a-c：队列3中2名患者脑转移组织和原发肺组织中CTSF、FBLN1和AKR1B10的免疫组化染色切片；d-f：队列3中10名患者脑转移组织和原发肺组织中CTSF、FBLN1和AKR1B10表达的相对定量比较，0：阴性，1：弱阳性，2：阳性，3：强阳性；g-h：对照患者的CTSF、FBLN1和AKR1B10的免疫组化染色切片。

结果二：ROC曲线分析建立NSCLC脑转移的预测诊断模型

作者用队列2作为训练数据集，以队列4作为验证数据集，通过逻辑回归算法建立了基于CTSF和FBLN1血清水平的组合诊断模型用于诊断NSCLC脑转移。ROC分析结果表明，CTSF与FBLN1的组合诊断性能优于单独的CTSF或FBLN1，且显著优于其他经典肺癌标志物。

图4  CTSF和FBLN1的受试者工作特性（ROC）曲线分析。a：单个蛋白（CTSF、FBLN1、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原125（CA125）、鳞状细胞癌抗原（SCC）和细胞角蛋白19片段（CYFRA211））诊断脑转移的ROC曲线分析；b：训练数据集中，LCBM患者相对于对照组（LM、BoM、ALC、ELC、PBT和健康组HG）的CTSF、FBLN1及其组合的ROC曲线分析；c：验证数据集中，LCBM患者相对于对照组（LM、BoM、ALC、ELC、PBT和健康组HG）的CTSF、FBLN1及其组合的ROC曲线分析；d：使用预测模型和临界值的验证数据集的验证结果，TP：真阳性，FP：假阳性，FN：假阴性，TN：真阴性。

结果三：CTSF可作为监测NSCLC脑转移患者治疗反应的随访生物标志物

除此之外，作者在临床随访期间定期检测了队列2中35例患者的血清样本，发现其中有25例患者CTSF血清水平变化与治疗效果变化一致，并且比影像学检查结果变化平均提前1-3个月。以上结果均表明，CTSF血清水平的变化可用于监测治疗反应，预测疾病的进展，对于调整治疗计划提供一定的参考。

图5  血清CTSF水平可预测NSCLC脑转移患者的治疗反应。a-f：队列2中6名NSCLC脑转移患者血清CTSF和FBLN1浓度的变化；g-h：患者1和患者2的脑部核磁共振图像。注：a和b中的i/ii/iii/iv对应于g和h中的i/ii/iii/iv；PR：部分缓解；SD：稳定疾病；PD：进展疾病；ADC：腺癌；SQCC：鳞状细胞癌；T：肿瘤期；N：区域淋巴结期。

结论

综上所述，CTSF和FBLN1被确定为早期诊断NSCLC脑转移的潜在生物标志物，此外，CTSF还可以用作评估治疗效果以及随访监测治疗反应的生物标志物。目前临床使用的肺癌标志物不能识别早期患有脑转移的NSCLC患者，因此CTSF和FBLN1可能有助于填补临床诊断空白，作为临床实践中MRI的补充或替代。

总结

此项研究采用多个独立的队列来验证候选生物标志物，病例数量较多，并对其中部分病例进行了纵向观察，最终筛选出能够早期诊断、实时监测病情以及评估治疗反应的生物标志物——CTSF和FBLN1，可信度较高。如果本研究采用了更合理的蛋白质组学应用和分析方法，结合现有的大规模临床队列，本文应该会有相当程度的提升。

在临床研究中，蛋白质组学可用于筛选疾病诊断和预测的分子标志物或解析疾病的分子机理，前者通常使用可以无创或微创获得的血清、血浆、唾液、尿液等体液样本，后者则通常使用疾病相关的病理组织或细胞样本。在临床样本难以获得的情况下，使用动物或细胞模型样本是一种较为理想的替代方案，也更便于后续进行基因编辑操作和更深入的机理探索和验证。

本研究中建立了NSCLC脑转移的小鼠模型并分离肿瘤细胞进行了蛋白质组学检测，但并未进行更深入的疾病机理探索和讨论。如果对其结果进行更深入的生物信息学分析和蛋白功能或机理方面的探索验证，例如分析原发癌细胞和脑转移癌细胞间的信号通路差异、敲除或过表达关键差异蛋白后检测肿瘤细胞脑转移相关的表型变化等，可能会对肺癌脑转移的分子机制进行更详细的阐释。

同时，由于样品类型和物种来源方面的巨大差异，本研究将从小鼠模型的组织细胞中筛选出的候选分子标志物在患者的血清中进行验证，成功率较低，并且可能遗漏一些血清中特有的蛋白分子标志物。如果以来源于患者的血清样品进行高通量蛋白质组学检测筛选差异蛋白作为潜在的分子标志物，结果可能更为准确和理想。

此外，在通过蛋白质组学定量比较筛选出数百个差异蛋白后，本文主要基于已有的研究报道，从中确认10个重点关注的候选蛋白。此种筛选方法需要大量的相关研究调研工作，并且由于个人的选择偏向，很可能会遗漏一些重要的或创新性更强的候选分子标志物。如果能够基于蛋白质组学数据，通过各种机器自主学习算法进行相关的重要性评分或模型构建，则可能无偏见的筛选出更可信的候选分子标志物。