前言

 

今天笔者和大家分享一篇由浙江大学医学院第一附属医院的李兰娟院士团队发表在《Cancer Communications》杂志上的文章，主题为“整合蛋白质组学揭示E3泛素连接酶SYVN1在肝癌转移中的作用”。 

 

 

研究背景

 

肝细胞癌(HCC)是一种生存率较低的癌症，常因肿瘤转移而导致预后不良。而血管侵袭是肿瘤转移的先决条件，其分子机制涉及复杂、多蛋白和高精度的调控，目前还未被阐释清楚。

 

泛素化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，包含多步酶促反应。泛素化的失调能促进癌细胞的增殖、生存和转移，特别是E3连接酶被发现与癌症的临床预后密切相关。但泛素化与癌症转移的关系还未有系统性的研究。

 

这篇文章通过全细胞蛋白质组和泛素化修饰组学分析肝癌的发生和转移。并系统地研究了SYVN1（一种保守的内质网E3连接酶）的相互作用蛋白质组，探讨了SYVN 1在HCC转移中的潜在作用和机制。

 

实验设计：分子机制研究

 

 

图1：研究思路

 

本研究的目的在于探讨HCC血管侵袭的分子机制，首先通过临床样本的蛋白组学检测寻找到关键的蛋白和分子通路，样本来自于浙江大学第一附属医院从2017年10月至2018年7月间收集的接受手术切除的肝癌患者。最终用于组学检测的样本共30例，其中15例为无血管侵袭的HCC患者组织样本，另15例来源于有血管侵犯的HCC患者。通过泛素组分析发现两组样本中蛋白质泛素化修饰的水平和模式有明显差别，结合全细胞蛋白质组的差异蛋白分析，预测了E3连接酶SYVN1分子在HCC的发生和血管生成中起重要作用。然后通过动物和细胞模型进行验证和分子机制探索。

 

 

图2：蛋白质组学工作流程

 

 

结果一：泛素组、蛋白质组在HCC的发生和血管侵袭中表现出差异

 

通过TMT定量蛋白质组学技术, 结合基于泛素化基序抗体的富集技术，分析了两组样本中全蛋白表达水平和泛素化蛋白水平，研究团队成功地从HCC中鉴定了总共11913个diGly（Lys-ε-Gly-Gly）修饰位点和4317个diGly-修饰蛋白（TABLE2）。

 

 

 

主成分分析和聚类分析显示，有血管侵袭和无血管侵袭的HCC组织样本中蛋白质表达水平和泛素化水平都存在明显差异（图3）。

 

 

图3

 

通过分析泛素化修饰蛋白组发现，肿瘤组织的泛素化修饰位点数与瘤周组织相比显著上调，并且这种现象在有血管侵袭的HCC中更明显（图4A）。位于泛素本身上的泛素修饰位点数能够体现泛素链的长度，在无血管侵袭肝癌组织样本中上调更加明显（图4C）。因此推测发生血管侵袭和转移后，泛素化的位点增多了，但泛素链的长度反而缩短了（图4F）。

 

 

图4

 

结果二：SYVN1是HCC发生和转移最重要的E3泛素连接酶

 

通过比较有无血管侵袭的HCC组织的显著差异的泛素化修饰位点（图5A和5B），并结合SYVN1在有血管侵袭的HCC中上调而在无血管侵袭的HCC组织中无变化这一现象，作者推测SYVN1是增加HCC血管侵袭的最重要的E3泛素连接酶（图5C）。

 

全细胞蛋白质组学数据和免疫组化实验也显示，在有血管侵袭的HCC组织中 SYVN1的表达增加（图5D、E）， 并且来自TCGA数据库的HCC患者总生存期曲线也表明， SYVN1高表达与HCC预后不良相关（图5F）。

 

 

图5

 

结果三：SYVN1影响细胞迁移和血管生成

 

为了阐明SYVN1在HCC转移中的作用，作者通过构建细胞/动物模型，确定其对癌细胞增殖的影响。结果表明，SYVN1在裸鼠体内和在血清缺乏的培养基中能促进肝癌细胞增殖（图6）。

 

 

图6

 

敲低了SYVN1后的肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力都有下降（图7B、D），并且与血管生成相关分子的mRNA表达水平也下降了（图7E）。说明SYVN1在癌细胞迁移和血管生成过程中起到了作用。

 

 

图7

 

 

结果四：SYVN1与HSP90相互作用并增加EEF2K泛素化

 

为了揭示SYVN1影响HCC转移的机制，作者使用质谱技术鉴定了在LM3和HUH7细胞系中与SYVN1相互作用的分子。结果表明，HSP90家族成员和SYVN1之间存在相互作用（图8A、B）。在全细胞蛋白质组学数据中，有血管侵袭的HCC中HSP90家族蛋白及其共伴侣在肿瘤组织中的表达显著高于相应的瘤周组织（图8E）。另外来自GEPIA数据库的转录组数据表明，与正常组织相比，EEF2K在肿瘤组织中的表达增加(图8G)。IP和Western blotting实验也显示在肝癌细胞中SYVN1增加了EEF2K泛素化水平(图7H)。

 

 

图8

 

结论

 

研究表明，在有和没有血管浸润的HCC组织中，泛素化蛋白组有显著的差异。其中SYVN1是导致这一现象的最重要的E3泛素-蛋白连接酶，它与肿瘤的转移和血管的生成有关。因此，SYVN1可能是HCC的潜在治疗靶点。

 

总结

 

本研究联合泛素组和全细胞蛋白质组学分析HCC的发生和转移，证明SYVN1是其中起作用的关键分子，然后通过构建细胞/动物模型进行功能的验证，探索可能的分子机制。但文章并未明确SYVN1、HSP90和EEF2K之间的关系以及EEF2K在HCC转移中的作用。

 

本文主要进行的是癌症转移机制的研究，但其实蛋白质组学的应用范围非常广泛，同样是以肝细胞癌这种疾病作为我们的研究主体，我们其实还可以使用蛋白质组学技术拓展其它研究方向，比如：（1）将研究样本换成其他类型的无创样本（血浆、血液等），可用于发现与疾病相关的分子标志物，用于肝癌的辅助诊断，或者用于鉴别诊断高分化肝细胞癌和发育不良结节；（2）还可以通过对差异蛋白的筛选和建模，对HCC进行分子分型的研究；（3）进行危险分层的研究，评估出现肝细胞癌（HCC）的风险、临床治疗后肝癌复发的风险；（4）或者进行疾病抗药性的分子机制研究；（5）进行病因与危险因素的研究，比如非酒精性脂肪性肝疾病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）与HCC发生与进展的关系及其具体的关键分子机制；（6）将研究人群换成HCV患者人群或者是HBV与HCV/HDV共同感染的人群（本文研究的全部为HBV人群），也可以成为新的研究方向。