前言

 

口腔癌(OC)是全球15种最常见的癌症之一，主要来自上皮细胞，按发病部位分为舌癌、口底癌、牙龈癌、颊癌、腭癌，病理类型以鳞状细胞癌（OSCC）为主，约占90%。OSCC是最常见的形式的头颈部肿瘤，虽然手术切除结合化疗和放疗已广泛应用，但近20年OSCC患者的5年整体生存率不超过50%，大多数转移性OSCC患者在一年内死亡。口腔癌的病因不明，诱因包括吸烟喝酒、咀嚼槟榔、病毒感染、遗传、环境等。口腔癌早期症状与一般的口腔黏膜病变类似，主要包括黏膜硬结，表皮溃疡，表面呈红色间以少许白斑，偶有刺激性疼痛等。目前，口腔癌的治疗方法为手术为主的综合治疗，然而如手术不彻底则术后易复发，预后一般。

 

那么，针对这种疾病如何开展临床研究？ 

 

解读

 

本专题为大家带来四篇口腔癌相关研究论文的解读，总结不同研究类型适用的研究方法，以及蛋白质组学在临床研究中的应用。四篇文章的研究目的、研究设计和期刊的分区均有不同，代表了不同科研条件下适用的研究设计，供大家参考。

 

 

 

 

前两篇是对口腔癌诊断标志物的研究。早期发现OSCC可以提高生存率，减少手术切除治疗后的复发率，并显著减轻患者的经济负担。然而，目前OSCC的检测（肉眼检查口腔，活检检测癌细胞）有局限性。研究者希望通过唾液蛋白质组学研究寻找一种具有高灵敏度和特异性的诊断生物标志物，来显著提高OSCC的早期发现率。

 

Part. 1

 

第一篇发表于In vivo（2.406），题为Identification of Salivary Proteomic Biomarkers for Oral Cancer Screening，本文的目的为寻找区分口腔癌患者（OC）和健康对照者（HC）的唾液中的蛋白诊断生物标志物。

 

 

▲ 主要内容

 

本研究共纳入39 例口腔癌患者和31例健康人，患者信息如下表所示：

 

 

收集唾液后，经过非标记定量蛋白质组学检测，定量到23个差异表达蛋白。随后通过有效值筛选，秩和检验以及多元逻辑回归从中筛选出6个蛋白质，α-2-巨球蛋白样蛋白1（α-2- macroglobulin-like protein 1）、cornulin、血红蛋白亚基β（hemoglobin subunit β）， Ig ĸ chain V-II region Vĸ167，激肽原-1（kininogen-1）和跨膜蛋白酶丝氨酸11D（transmembrane protease serine 11D）。这6种蛋白质的组合能较好区分口腔癌患者和健康人，具有用于OC无创筛查的潜力。

 

 

▲ 研究方法总结

 

临床研究方法：本研究属于诊断研究，寻找区分口腔癌和健康人的生物标志物。试验方案为横断面研究，将人群分为口腔癌患者和健康人两组，以健康人作为对照组。只有之前未接受过化疗或放疗等辅助治疗的患者被纳入研究，且所有口腔癌患者均经手术活检进行病理诊断。对照组为院内体检结果健康的人。

 

变量：使用非标记定量蛋白质组学的方法对收集的70份唾液样本中的蛋白质进行定量检测，得到蛋白质定量结果。

 

统计方法：非参数曼-惠特尼秩和检验，以p<0.05为标准初步筛选差异蛋白。

 

使用多元逻辑回归的方法筛选出具有预测效果的潜在诊断标志物，建立模型。

 

验证：无。

 

▲ 可完善之处

 

研究仅纳入39 例口腔癌患者和31例健康人，样本量较小。

 

仅建立了诊断模型，但未对模型进行验证。

 

口腔癌包括口腔鳞状细胞癌，疣状癌、腺癌、原位癌等，该研究未区分癌症种类。

 

Part. 2

 

第二篇发表于Molecular & Cellular Proteomics，题为“用非靶向和靶向定量蛋白质组学方法发现口腔癌检测的唾液生物标志物”（Identification of Salivary Biomarkers for Oral Cancer Detection with Untargeted and Targeted Quantitative Proteomics Approaches），本文的研究目的是发现有应用价值的口腔鳞状细胞癌唾液诊断生物标志物。

 

 

 

▲ 主要内容

 

本文的流程如下图所示，包括候选标志物发现阶段，定量蛋白质组学验证阶段和基于抗体的验证阶段。

 

第一阶段，作者纳入了10例健康对照，9例口腔潜在恶性疾病（OPMD）和10例口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者，将三组样品分别混合后进行iTRAQ标记定量，在OSCC/HC及OSCC/OPMD两组中，同时定量到67个差异上调蛋白。

 

 

 

 

 

第二阶段，作者纳入了30例健康人，28例OPMD和29例OSCC患者，将此作为第一个验证队列，使用靶向蛋白组的方法对第一阶段定量到的差异蛋白进行验证。结果显示，共有24种蛋白通过MRM的方法得到了验证，其中6种蛋白（APOA1, APOA4, CFH, FGA, SERPINA1, SERPIND1）可以有效区分OSCC患者和健康对照（AUC ≥ 0.8）。

 

 

 

第三阶段，作者纳入了100例健康人，55例OPMD和77例OSCC患者，通过ELISA测定唾液样本中CFH、FGA 和SERPINA1的含量，进一步验证这些蛋白的预测能力。与健康对照组 (p < 0.001) 和 OPMD 组 (p < 0.01) 相比，OSCC 组的唾液中CFH、FGA 和 SERPINA1 水平显著升高。三种蛋白均可以区分OSCC/HC组或OSCC/OPMD组。三种蛋白的组合，区分OSCC和健康人效果更好，AUC = 0.751（95% CI, 0.676–0.826）。

 

 

 

随后，作者进一步使用这三个蛋白标志物对口腔癌的筛查能力和预后进行预测。与健康对照组相比，早期原发性肿瘤、无淋巴结转移和早期Stage分期阶段患者的唾液 FGA和 SERPINA1水平显著升高，且早期原发性肿瘤患者唾液CFH水平高于健康对照组。

 

晚期原发性OSCC（pT-T3/T4）OSCC患者唾液FGA和SERPINA1水平高于早期原发性OSCC（pT-T1/T2；p < 0.01）。与没有淋巴结转移的患者（pN-N = 0；p < 0.01）相比，有淋巴结转移（pN-N > 0）的 OSCC 患者的唾液中三种蛋白质的水平均显著升高。

 

 

 

 

Stage分期为 III-IV 的 OSCC 患者与分期为 I-II 的患者相比，三种蛋白质的水平同样均显著升高。结果表明 CFH、FGA 和 SERPINA1 在唾液中的水平对于 OSCC 预后预测可能有效。

 

 

▲ 研究方法总结

 

本文属于常见的诊断biomarker的发现流程：即横断面研究、样本量由小到大、候选蛋白由多到少，并简要涉及对预后的预测。

 

临床研究方法：本研究属于诊断研究，寻找区分健康人，口腔恶性疾病和口腔癌的诊断生物标志物。试验方案为横断面研究，将人群分为口腔癌患者、口腔恶性疾病和健康人三组。所有志愿者都接受了口腔黏膜筛查试验。对照组为院内体检结果健康的志愿者。

 

变量：将收集的29 (10 HC，9 OPMD, 10 OSCC）份唾液样本按组合并，得到三个样本，使用iTRAQ标记定量蛋白质组学的方法进行蛋白质定量检测，进行3次技术重复，得到蛋白质定量结果，取三组交集得到差异蛋白。

 

将收集的87 (30 HC，28 OPMD, 29 OSCC）份唾液样本，使用质谱多反应监测（MRM-MS）的方法进行靶向蛋白质定量检测，从酶解开始进行3次技术重复，验证差异蛋白。

 

统计方法：第一阶段以log2 ratio高于mean+S.D.为标准确定上调蛋白，log2 ratio低于mean - S.D.为标准确定下调蛋白。

 

第二阶段使用非参数曼-惠特尼秩和检验，以p<0.05为标准筛选MRM验证的差异蛋白。并通过受试者工作特征曲线（ROC）曲线下面积（AUC）分析，以AUC > 0.8 为标准筛选MRM验证成功的差异蛋白。

 

验证：将收集的232 (100 HC，55 OPMD, 77 OSCC）份唾液样本，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法进行蛋白质定量检测，进行2次重复，验证差异蛋白。第三阶段通过受试者工作特征曲线（ROC）曲线下面积（AUC）分析验证候选标志物的预测效果，并使用逻辑回归的方法验证标志物组合验证效果。

 

▲ 可完善之处

 

第一阶段在进行iTRAQ标记定量时，将同组的样本混合进行检测以减少个体间差异的影响，但这种样本处理方式可能会掩盖关键信息，不利于后续统计分析。

 

蛋白质组学检测定量蛋白偏少，目前可选择效果更好的检测方法。

 

在蛋白筛选方面可以选择差异倍数、机器学习、LASSO、WPCNA等多种方法，且可以结合临床指标构建诊断模型、预后模型。

 

结语

 

如何寻找更适合您的研究方式呢？本文分享的两篇研究论文聚焦于生物标志物的发现，特点总结如下：

 

第一篇文章的研究目的为发现新的诊断标志物，所需样本为临床样本，无需基础科研实验室进行分子、细胞或动物实验。此类研究对样本数的要求较低，仅对数据进行简单的分析和建模，可快速得到研究成果。

 

第二篇文章的研究目的同样为发现新的标志物，所需样本为临床样本，无需基础科研实验室。与第一篇相比，明确了疾病的亚型，样本量要求更大。研究过程分为发现、验证和确定三个阶段，在数据分析方面也更为复杂，不但建立了诊断和预后模型，还在更大的队列中进行了验证，且对疾病的不同分期进行了预测，研究成果更有价值。

 

在下一篇文章中，我们将针对两篇聚焦于分子机制探究的论文进行解读。

 

参考文献

 

1. Ishikawa, S., Ishizawa, K., Tanaka, A., Kimura, H., Kitabatake, K., Sugano, A., Edamatsu, K., Ueda, S., & Iino, M. (2021). Identification of Salivary Proteomic Biomarkers for Oral Cancer Screening. In vivo (Athens, Greece), 35(1), 541–547. https://doi.org/10.21873/invivo.12289

 

2. Chu, H. W., Chang, K. P., Hsu, C. W., Chang, I. Y., Liu, H. P., Chen, Y. T., & Wu, C. C. (2019). Identification of Salivary Biomarkers for Oral Cancer Detection with Untargeted and Targeted Quantitative Proteomics Approaches. Molecular & cellular proteomics : MCP, 18(9), 1796–1806.https://doi.org/10.1074/mcp.RA119.001530