前言

十二烷基硫酸钠(SDS)被广泛用于蛋白质组学研究的样本制备。然而，在LC-MS分析过程中，SDS与液相分离和电喷雾电离的过程是不相容的。因此，在进行LC-MS分析之前，需要将其去除。目前的蛋白质组学样本制备中大部分去除SDS的方法往往具有费时费力或重复性差等缺点。

今天笔者带来《Mol Cell Proteomics》杂志近期刊载的一篇方法学文章，利用环糊精（cyclodextrin，CD）能够与SDS在溶液中结合并形成复合物的特性，屏蔽掉蛋白提取液中SDS的活性，无需去除，直接进行后续的蛋白酶解，从而开发出了一种简洁、快速、稳定的蛋白质组学样本制备方法。该方法由厦门大学钟传奇博士团队和谱度众合（武汉）生命科技有限公司合作开发完成。

人物介绍

钟传奇  原文通讯作者

钟传奇，男，博士，厦门大学生命科学学院副教授。现从事的是基于蛋白质组学的生物信号通路研究。至2021年10月，已经发表29篇SCI论文，其中以独立通讯作者或共同通讯作者发表8篇论文，累计被引用次数为2464次，H指数为14，其中引用率最高的文章为915次。在2015年，钟传奇博士以共同通讯作者身份在世界顶级学术杂志“Nature Methods”上发表论文，发明了一种创新的蛋白质组数据处理软件，解决了蛋白质组学领域内的一大难题。

陈希  原文共同作者

陈希，男，博士，高级工程师，毕业于武汉大学生命科学学院，在校期间搭建了武汉大学第一个生物质谱平台，从事蛋白质组学研究工作。毕业后前往香港大学任职高级研究助理，继续从事生物质谱方向研究。2013年，前往武汉生物技术研究院，创建了生物质谱平台，负责平台的技术及管理运营，同时作为武汉生物技术研究院建院以来的第一个博士后，进行深造。2015年底，陈希博士荣获由湖北省人力资源和社会保障厅颁发的“湖北省企业研发人才”称号。2017年底，陈希博士依托武汉生物技术研究院创办了谱度众合（武汉）生命科技有限公司，担任公司总经理，从事：（1）临床蛋白质组学科技服务、（2）体外诊断试剂盒研发。目前，公司已获批国家高新技术企业以及武汉市科技“小巨人”企业。陈希博士在蛋白质组学领域拥有15年的科研和市场经验，发表SCI论文40余篇，申请国家发明专利9项，实用新型专利7项，软件著作权10项，并主持：（1）国家自然科学基金青年基金、（2）湖北省博士后创新岗位基金、（3）武汉市博士后科研启动基金。

方法原理

其原理是：蛋白质溶液中的SDS可以被环糊精“捕获”，生成CD-SDS复合物，从而屏蔽掉SDS活性，使得胰蛋白酶直接酶解蛋白形成多肽，然后通过脱盐将CD-SDS复合物去除，用于后续的质谱分析。这种基于CD的SDS去除策略应用于溶液中胰蛋白酶酶解样本的制备方法，称之为SDS-环糊精辅助样本制备(SCASP)。

结果一：SCASP方法的建立及特征分析

环糊精是一类外缘亲水而内腔疏水的环状低聚糖，可以与多种化合物形成主客体包合物。因此研究团队首先提出假设：溶液中的SDS可以通过添加CD在后续的脱盐过程中被去除，从而使得样本中蛋白可以直接进行酶解和后续LC-MS检测。后续对相关样本的质谱检测，成功验证了这一假设：在质谱检测中，添加HP-β-CD并进行脱盐后的SDS溶液中完全检测不到SDS和HP-β-CD的信号。

基于SDC的策略也称为inStageTip(iST)方法，也是目前较常用的一种简洁快速的蛋白质组学样本制备方法。这种方法以SDC替代SDS作为表面活性剂进行蛋白提取和促溶，并可在后续的脱盐过程中被去除。以小鼠L929细胞裂解液为实验材料，研究人员测试了多种因素，包括环糊精类型、环糊精与SDS配比、胰酶底物比例、蛋白量、酶解时间、SDS浓度等对SCASP方法的影响，并将其检测结果与iST方法进行了比较。

由于HP-β-CD的水溶性远高于α-CD和γ-CD，且在酸性条件下不沉淀，因此在后续实验中均选用了HP-β-CD。测试结果显示SCASP方法与SDC方法具有相似的性能，能够鉴定到数量相近的蛋白和肽段，检测重复性也相近。

结果二：SCASP与其他样本制备方法的比较

研究人员将SCASP与丙酮沉淀法和FASP这两种去除SDS的样本制备方法进行比较，结果显示SCASP分别比FASP和丙酮沉淀法鉴定到的蛋白数目增加21%和14%，鉴定到的肽段数目增加56%和26%。同时后两者方法中多次重复实验的变异系数也更高，这也符合预期，因为后两者方法中具有更多的实验步骤。

接下来对SCASP，iST和FASP三种方法进行了系统性的比较。从HeLa细胞中提取约100 μg蛋白，液相分离成20个组分进行DDA-MS分析，结果显示肽段鉴定结果中仅有约38.8%为三种方法共有，而蛋白鉴定结果中则有82.3%被三种方法共同鉴定。这可能意味着在不同的条件中，胰酶的酶解模式有所区别。而基因本体论（GO）分析显示，三种方法在前10位细胞定位条目中鉴定到的蛋白质数量是相似的，表明与SDC或FASP方法相比，SCASP方法不存在样本处理偏差。

结果三：SCASP在不同生物来源样本处理中的应用

接下来研究人员将SCASP应用于多种类型的生物样本，包括动物细胞、酵母菌、植物叶片、动物组织、石蜡切片等，并主要与SDC方法进行了对比。结果显示，对于动物细胞样本，即使是极微量的样本，SCASP方法也能鉴定到与SDC方法相近数量的蛋白和肽段。而对于其他类型样本，特别是针对动植物组织和FFPE样本，SCASP方法相比SDC方法可以鉴定到更多的蛋白和肽段。

结果四：应用SCASP分析VSV感染的THP-1细胞的动态总蛋白质组和膜蛋白质组

最后，作者利用SCASP方法来分析VSV感染的人THP-1细胞的蛋白质组和膜蛋白质组的动态变化。设置了5个感染处理时间，每个实验都进行了2次生物学重复。来源于全细胞蛋白和膜蛋白的肽段样本经过液相分离为多个组分后，分别以ddaPASEF (parallel accumulation serial fragmentation)的方法进行检测，从而建立了包含9487个蛋白和396778条肽段的深度谱图数据库。之后所有20个待测样本以diaPASEF方法进行质谱检测并靶向提取定量信息，最终定量到包含112876条肽段的7031个蛋白。主成分分析结果表明，生物学重复样本明显聚集，而膜蛋白样本和全细胞样本则得到显著区分。通过差异蛋白分析，筛选出了VSV刺激后，THP-1细胞中上下调的细胞蛋白和膜蛋白。例如， VSV刺激后，RAB18在膜组分中的蛋白丰度增加，而在总蛋白水平上保持不变。考虑到RAB18具有介导内质网-脂滴形成的功能，此结果揭示了RAB18从胞浆到膜的移位，可能促进VSV病毒粒子的组装。

总结

综上，SCASP是一种简单、快速、稳定的基于SDS的蛋白质组学样本制备方法。相比其他的SDS去除的蛋白质组学样本制备方法，SCASP方法实验步骤更简洁，通常能够获得更多的蛋白和肽段鉴定数量，样本重复性也更好。相比目前常用的SDC方法，SCASP方法在细胞样本中表现相近，而在其他，如酵母细胞、动植物组织等更具挑战的样本类型中，SCASP则能够获得更多的蛋白和肽段鉴定结果。