蛋白质之间的相互作用在几乎所有的生物学过程中都发挥着重要作用，研究蛋白质相互作用是理解许多生物学过程的基础。蛋白互作组学也是目前蛋白质组学研究的重要内容。

为了研究蛋白-蛋白之间的相互作用，研究者们开发了许多研究方法。截至2021年底，在最大的蛋白互作数据库之一的Biogrid数据库中，共收录了来源于17种不同实验方法的145万多条蛋白互作信息。在Biogrid收录的这些研究方法中，Affinity Capture-MS，Proximity Label-MS和Co-fraction均为基于质谱的研究方法，这三种方法合计贡献了超过60%的蛋白质互作数据。

如果统计近10年来的蛋白互作数据，也可以看到，基于质谱的研究方法所鉴定到的蛋白互作数量在总数中的占比也越来越多。受益于质谱仪器性能和分析方法的进步和发展，基于质谱的蛋白互作研究方法已经越来越受研究者们青睐了。

1、AP-MS方法

Affinity Capture-MS是目前应用最广泛的蛋白相互作用研究方法。这种方法也被称为AP-MS（Affinity Purification coupled MS），即亲和纯化串联质谱分析。AP-MS的主要原理是基于特异性抗体或其他亲和试剂与靶标蛋白的亲和作用，通过免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation）将靶标蛋白与靶标蛋白的相互作用蛋白从复杂的生物体系中纯化出来，进而进行质谱检测以鉴定靶标蛋白的相互作用蛋白。经典的AP-MS实验通常包含以下4个关键步骤：1）细胞或组织的裂解；2）蛋白溶液与偶联抗体的亲和微珠的孵育；3）非特异性结合和背景蛋白的清洗以及特异性互作蛋白的洗脱；4）互作蛋白的质谱检测和分析。

理想的AP-MS实验会通过特异性抗体亲和纯化内源性表达的诱饵蛋白以检测更接近生理状态下的蛋白相互作用，但这种方案如果存在诱饵蛋白的内源表达水平低或抗体的效价不高的情况，将难以获得良好的实验结果。因此，很多研究者会选择在细胞体系中过表达带有融合标签（例如Flag，Myc，HA等）的诱饵蛋白，针对蛋白标签进行亲和纯化，以获得更好的检测结果。

2、 BioID方法

Proximity Label-MS是近年来发展并完善的一种鉴定蛋白相互作用的新方法。这种方法也被称为PDB-MS（Proximity-dependent biotinylation coupled MS）或BioID（Proximity- dependent Biotin Identification）。这个方法的主要原理是在诱饵蛋白上融合表达具有生物素连接酶活性的蛋白标签，这样表达的融合蛋白会将其临近的其他蛋白上加上生物素标记，随后通过亲和富集将具有生物素标记的蛋白纯化并鉴定，这些被标记上的蛋白即被鉴定为诱饵蛋白的相互作用蛋白。

经典的BioID方法使用的蛋白标签来源于大肠杆菌中一个35KD的生物素连接酶蛋白BirA。在此基础上，基于一种超嗜热菌来源的分子量更小、反应活性更高的蛋白标签，开发出了新一代的BioID2方法。这种传统的BioID方法往往需要12-24小时的孵育反应时间。而通过对BirA酶的进一步生物工程改造，获得了标记反应速度更快（10分钟内）的改进方法，也就是TurboID和miniTurboID。除了这些基于BirA标签开发出的BioID方法以外，还有一些基于其他蛋白，如Horseradish peroxidase (HRP)或peroxidase (APEX)开发出的生物素标记方法。这些蛋白具有各自不同的反应条件，因此对应的方法也适用于不同的实验体系。

3、 Co-fraction方法

Co-fraction，即共分离技术，也是一种经典的蛋白相互作用研究方法。这种方法的基本原理是，在非变性条件下，通过色谱或电泳技术将含有蛋白复合体的溶液进行分离，对每一个分离到的组分分别进行质谱鉴定。在相同组分中被鉴定到的，或者在不同组分中定量趋势一致的蛋白，会被认为属于相同的蛋白复合体，这些蛋白之间会被鉴定存在蛋白相互作用。

在共分离方法中，保证蛋白复合体的完整性十分关键，因此此方法通常会使用尽量少的裂解液，在冷冻、非变性的条件下对细胞或组织进行快速裂解。共分离技术的另一个关键点是蛋白复合体的分离方法。目前较常用的液相色谱分离方法包括排阻层析（Size-exclusion chromatography，SEC），离子交换（ion-exchange，IEX）和疏水结合层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC），可根据蛋白复合体的大小、电荷或疏水性对其进行分离。除了通过液相色谱分离可溶性蛋白复合体之外，利用非变性凝胶电泳，比如BN-PAGE，也可以用来分离与生物膜结合的蛋白复合体。

4、TPCA方法

除了以上提到的3种目前较常用的蛋白相互作用研究方法外，近年来，还有一种基于质谱的方法被应用于蛋白相互作用研究，即TPCA（Thermal proximity coaggregation）。这种方法也被称为CETSA（Cellular Thermal Shift Assay），或TPP（Thermal Proteome Profiling），是由小分子药物靶标筛选技术TSA（Thermal Shift Assay）发展而来。这种方法的主要原理是利用了互作蛋白在热刺激条件下变性后的聚集和共沉淀现象，即相互作用的蛋白往往具有相似的热稳定性，会在相同的温度刺激下变性聚集和沉淀下来。

在TPCA方法中，通常会以8-10种不同的温度梯度对生物样品进行相同时间的热刺激，之后离心去除蛋白沉淀，通过基于质谱的TMT稳定同位素标记等蛋白质组学定量策略对溶液上清中的蛋白进行定量分析，并绘制各个蛋白的溶解曲线。溶解曲线高度一致的蛋白，会被认为可能是存在相互作用的蛋白。这种方法也可根据蛋白溶解曲线的迁移分析不同条件下蛋白相互作用的变化。由于每个样品均需以多种不同温度进行刺激并检测，其质谱检测成本较高，不过最近也有研究表明，如果选择合适的刺激温度，2-3个温度点即可获得良好的检测和分析结果。

总结

以上介绍的4种方法均是基于质谱检测的蛋白相互作用研究方法，不同方法各有特点，例如BioID无需在样品制备时保持蛋白相互作用的稳定性，可采用更剧烈的细胞裂解和蛋白提取方法，因此可应用于膜蛋白或核蛋白等常规方法难以检测的蛋白相互作用；Co-fraction和TPCA可在无靶标的情况下无偏见的检测细胞中更广泛的蛋白相互作用，可以作为高通量互作组学的研究方法。不过目前，AP-MS仍是蛋白相互作用研究中最经典、应用最广泛的研究方法。而在AP-MS中，最常用最经典的亲和纯化方式是IP，即IP-MS是目前最常用的AP-MS方法。在后续的系列文章中，我们将对IP-MS方法各方面进行更详细的介绍。

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